樊赞等miRO44t通过对肝细胞生长因子的调控抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖、迁移及延缓肝癌进展第O期•2101• miRT44t通过对肝细胞生长因子的调控抑制肝癌细胞
MHCC57H的增殖、迁移及延缓肝癌进展
樊赞、樊纪民2卞华、
(1南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南南阳678600；2河南省南阳市卧龙区中医药管理局)
〔摘要〕目的研究miRTO/通过对肝细胞生长因子(HGF)的调控作用对肝癌细胞MHCC97H增殖、迁移及肝癌进展的影响。方法qRT-PCR检测肝癌肿瘤组织和癌旁正常组织中miRP44的表达量；检测miRT44在各株肝癌细胞中的表达量；验证miRB44的潜在靶基因HGF；q RT-PCR和Western印迹检测miRT44mimics对HGF mRNA及蛋白表达的影响；q RT-PCR检测各株肝癌细胞及肝癌肿瘤组织中HGFmRNA表达量的影响；用免疫组化实验检测肝癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织中HGF的表达量；用CCK8实验检测各转染组OD值；流式细胞法检测各转染组2期细胞比值；细胞划痕实验检测细胞迁移效果；构建肝癌皮下种植裸鼠模型检测肿瘤组织重量；根据K160与苏木素-伊红(HE)染检测各转染组阳 性信号。结果miRB44可能与肝癌的发生及发展存在相关性;miRB44能够抑制HGF mRNA及蛋白的表达(P<4.4();HGF可促进肝癌的发展；miRB44可抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖，迁移和细胞周期在S期聚集，而这些抑制效果可被HGF补回(P<4.4((；miR-14/能够抑制HGF的表达量并抑制肝癌细胞的增殖(P<4.4()。结论miRT44可通过抑制HGF从而抑制肝癌的发展，可能成为肝癌诊断及的新靶点。
〔关键词〕肝癌;mOB44；肝细胞生长因子
〔中图分类号〕R735.4〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-1222(2021)10-110115:doi:10.2966/j.issn.1005-1222.2021.10.044
肝细胞癌(HCC-是原发性肝癌(PLC-的病理类型之一，占比达99%以上，肝癌发病率居世界癌症发病率第五位，致死率居第二位〔〕，我国肝细胞癌发病率占世界总数的55%〔〕，且发病率逐年增加。近年，肿瘤分子靶向成为肝癌的热点，临床上细胞分子靶向对于肝癌，尤其是晚期阶段发挥重要作用〔〕。肝细胞生长因子(HGF)由肝脏间叶细胞分泌，可调控多种组织及细胞增殖分化，如启动肝再生、促细胞分裂、运动、抗凋亡等⑷。HGF主要通过与c-met形成二聚体，激活磷脂酰肌醇O-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)等通路，发挥其生物学功能〔〕。miRNA是一种单链非编码小分子RNA，它可调控人类基因组中约三分之一基因的表达，研究表明，近一半已知miRNAs与肿瘤相关，发挥致癌或抑癌作用〔〕。本研通过分析miRT02对靶基因HGF调控作用，为诊断及肝癌提供新的研究方向。
1材料与方法
21组织样本采集收集2016年12月至2013年5月就诊于南阳理工学院附属医院病理科确诊为肝
通信作者：卞华(10750，男，博士，教授，主要从事肝脏疾病研究。
第一作者：樊％(12880，女，硕士，助教，主要从事肝脏疾病研究。癌的患者69例，其中男51例，女7例，平均年龄(55.29±8.41)岁。采集肝癌组织及匹配癌旁组织，肝癌组织均由病理学医师共同诊断，且取样前未行放化疗。
24方法
1.2.1标本采集清晨空腹采集肝癌患者外周静脉血3mi,1006r/min离心12min，采集血清, -80C保存待测。
1.2.2qRT-PCR检测miRT22表达量取6.5ml 血清标本，采用Trizol法提取血清总RNA，进行RNA逆转录，合成cDNA，进行PCR反应。实验步骤均按照试剂盒中说明书进行。
1.2.3细胞培养和转染肝癌细胞SMCC7721、MHCC97H、LM3和HeyG2及人肝上皮细胞THLE-3均购自上海中科院细胞库。测定及比较上述细胞中miRT44表达量、HGF mRNA及蛋白表达。选取MHCC9
7H细胞进行后续实验。DMEM培养基(37C,5%CO0)培养MHCC97H细胞，分为miR-NC 组、miRO44组、miRT44+HGF组，分别转染阴性对照miRNA模拟物(mioicr-、miR-196mimics、miR-102mioicr+HGF，均根据Lipofectamioe TM2000的转染试剂说明进行转染。
22.2荧光素酶检测实验经miRNA靶基因数据库，预测出miRT02与HGF的可能结合位点。构建
-232-中国老年学杂志202（年5月第4（卷
HGF野生型3Z-RTR荧光素酶质粒pMIR-WT和突变型质粒pMIR-Mum将MHCC97H细胞进行分组，分别转染野生型质粒pMIR-WT、突变型质粒pMIR-Mut与miR-144mimics和阴性对照miRNA mimics°检测各组荧光素酶活性。
1・2・5Western印迹检测经分离凝胶蛋白电泳（电压32V、与浓缩胶蛋白电泳（电压4V）进行蛋白分离，之后进行转膜,TBST室温下封闭7h，加入HGF抗体（7：544）和GAPDH抗体（7：1004）, GAPDH为内参,4C孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（、：、004），室温孵育7h，电化学发光（ECL）试剂盒（MUipore公司-显影，凝胶成像系统扫描,Get Image System软件进行分析。
1.2・6CCK3检测将miR-EC组、miR-144组及miRD44+HGF组细胞转染24h后，接种于96孔培养板，每孔加3mi CCK3，详细步骤按照试剂盒说明书步骤进行,44nm波长处测定OD值。
1・2・7细胞划痕实验检测将miR-NC组、miR-144组及miRD44+HGF组细胞经胰酶消化，吹打为单细胞悬液,24h待细胞长成单层弃去培养液，在孔中央进行划痕，显微镜下拍照，测量并计算24h 细胞迁移距离。
02・2流式细胞法检测取miR-NC组、miRD44组、miRD44+HGF组细胞通过胰蛋白酶消化后，吹打成单细胞悬液，以2x19个/ml浓度接种于24孔培养板中。培养液培养，细胞贴壁后加入54ng/ml 的HGF°待消化后收集细胞，并通过离心弃除上清液，以PBS洗涤2次，缓冲液悬浮细胞，加入膜联蛋白V，混匀，再加入核酸荧光染料碘化丙啶，混匀后避光反应，流式细胞仪检测°
1・2・9构建肝癌裸鼠模型3只裸鼠,75%酒精常规消毒后肢,4号注射针经皮穿刺，将阴性对照miRNA mimics（miR-EC组-,miR-144mimics转染（miRD44组）进MHCC97H细胞并注射到裸鼠皮下（4.2mi，约含细胞2X147个（，正常饲养，每日给药7次，隔日称重，3d后眼球取血，以颈椎脱臼法将其处死，剥取肿瘤组织，置甲醛固定。
04统计学方法采用SPSS22.4软件进行方检验、单因素方差分析、SNK r检验。
2结果
/1肝癌患者细胞中miRD44的表达量肝癌组织中miRD44表达量明显低于癌旁正常组织［（4.28±4.45）
va（7.04±4.27-、，差异具有统计学意义（二5.453,P二4.045（°miRD44在THLE-V、SMCC7727、MHCC97H、LM3和HepG2中的表达量分别为（7.04±4.27-、（4.77±4.〕-、（4.34±4.43-、（4.52±4.47）和（4.53±4.〕-，组间比较差异有统计学意义（F二9.613,P二4.442-°SMCC7727、MH-CC97H、LM3和HepG2中miRD44的表达量均明显低于THLE-3，差异均有统计学意义（二16.335, 22.43,13.277,17.336；P均<4.04（（°
/.9miRD44通过结合HGF的3Z-RTR来抑制HGF的表达miRNA靶基因数据库预测结果显示, HGF为miRD44潜在靶基因（图7（°双荧光素酶活性检测结果显示，对于WT-HGF野生型报告基因质粒,miRD44组的荧光素酶活性明显低于miR-NC组［（〕•77±7.3）va（33.42±7.87），二〕.47,P二4.04（〕°对于Mat-HGF突变型报告基因质粒，两组荧光素酶活性无显著差异〔（35.82±3.42）a （33.42±3.37）；二4.957,P=4.527］°
miRD44组HGF mRNA表达水平明显低于miR-EC组〔（939±945-a（7.4±4.27-，二4.394,P二 90037<4.47〕°Western印迹检测结果显示,miRD44组HGF蛋白表达水平较miR-EC组明显降低，差异有统计学意义〔（4.34±4.13）a （7.4±4.27）,i二4.623,P v4.47〕°见图2°上述结果说明，miRD44能够抑制HGF mRNA及蛋白表达°
HGF3UTR5'...
I Imirna靶基因分析
hsa-miR-144-3p3'UCAUGUAGUAGAUAUGACAU
图1HGF为miR-14的潜在靶基因
miR-NC组miR-144组
2・4HGF在肝癌组织及细胞中mRNA及蛋白的表达HGF在THLER、SMCC7727、MHCC97H、LM3和HepG2中mRNA的表达量分别为（7.4±4.〕）、（7.27±4.27-、（7.54±4.26-、（7.47土4.16-和（7.4±4.27），组间比较差异有统计学意义（F二6.416,P二4.003）°SMCC7727、MHCC97H、LM3和
樊赞等miRT44t通过对肝细胞生长因子的调控抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖、迁移及延缓肝癌进展第2期-223-
HepGO中HGF mRNA的表达量均明显高于THLE-S 7二15.554J2.473J5.032J8.446；均<4.041〕。
肝癌肿瘤组织中HGF mRNA表达量明显高于癌旁正常组织〔(2.32±4.42、a(2.2±4.23、j二23.32,Pv4.42〕。
免疫组化实验结果显示，肿瘤组织中、癌旁正常组织中HGF阳性染细胞数分别为(125.54±H.09)个/HP、(37.20±3.53)个/HP,HGF在肿瘤组织中的表达量明显高于癌旁正常组织9二40.636,Pv4.041)，见图3。以上结果表明,HGF可促进肝癌的发展，而miR-142通过抑制HGF的表达参与肝癌的进展。
癌旁正常组织中
HGF
肝癌组织
图9HGF在肝癌组织及癌旁正常组织中的
表达(IHC,x22)
24miR-142和HGF与细胞增殖，迁移及周期的相关性miR-NC组、miR-142组、miR-142+HGF组的OD值分别为J4.69±4.15)、(4.58±4.22)、(-•34±4.15)o miR-142组的OD值低于miR-NC组，但差异无统计学意义((二4.992,P二4.377、。miR-142+HGF组的OD值明显高于miR-142组，差异有统计学意义7二5.853，户二4.044)。
流式细胞法检测发现,miR-142组S期细胞比值〔(14.46±2.33)%〕低于miR-TC组［(15.H±
3.45)%〕，但差异无统计学意义9=2.498,P二
4.142)o而miR-142+HGF组S期细胞比值〔(24.54±2.66)%〕明显高于miR-142组，差异有统计学意义9二4.937,P二4.78)。
细胞划痕实验结果显示，2h后miR-TC组、miR-144组、miRT44+HGF组的细胞迁移个数分别为(135.62±22.33、个、(35.42±6.66、个、(02.33±19.56)个。miR-142组细胞迁移细胞数明显低于miR-NC组，差异有统计学意义9二H.164,P< 4.042)。miR-142+HGF组细胞迁移数明显高于miR-142组，差异有统计学意义9=22662,P< 4.042)。见图2o以上结果表明，miRA44可抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖，迁移和细胞周期在S期聚集，而这些抑制效果可被HGF补回。
图4各组细胞迁移实验(x44)
22miR-142抑制裸鼠皮下肿瘤进程miR-142组肿瘤组织重量明显低于miR-TC组J4.14±4.20)a(4.52±4.H)g〕，差异有统计学意义9= 7.429,Pv4.041)。miR-142在miR-142组中的表达量明显高于miR-TC组〔(7.56±2.42)a(2.2土4.2)〕，差异有统计学意义9=13.05,P<4.041)、HGF在miR-142组中的表达量明显低于miR-NC组〔(4.33±4.45)a(J.2±4.13)〕，差异有统计学意义9二14.922,Pv4.242)。
Ki67染结果显示，miR-NC组A miR-142组的Ki67阳性染细胞数分别为(69.35±14.30)个/ HP216.99±3.47)个/HP,miRU44组的Ki67阳性染细胞数明显低于miR-NC组，差异有统计学意义J二13.642,Pv4.041)。见图5。
HE染结果显示，miR-NC组A miR-142组的阳性染细胞数分别为I12.25±13.40)个/HP、(52.33±6.32、个/HP,miR-142组的阳性染细胞数明显低于miR-TC组，差异有统计学意义9二2.442』<4.042)。见图5。以上结果说明miR-142能够抑制HGF表达并抑制肝癌细胞的增殖
。
-216/-中国老年学杂志202（年5月第4（卷
miR-144组
图5miR-144抑制裸鼠皮下肿瘤进程（X45）
3讨论
目前研究示HCC、肝内胆管癌及混合性肝癌等为PLC主要病理类型，其中HCC占比达94%以上⑺。肝癌在发展中国家的发病率远高于发达国家，我国则是其发病率及死亡率较高的国家之一⑻。
miRNA在人类基因表达及肿瘤发生中发挥着重要作用，其中miRT44在多种肿瘤中均发挥抑制作用。研究表明，在肺癌中，miRT44可通过控制凋亡调节因子的表达影响肿瘤细胞的增殖和凋亡⑼；在肝癌中，通过对肝癌组织和细胞中检测发现,miR-7/可通过调节转录因子（E2F）3的表达，对肝癌细胞的生长产生影响〔7〕。本研究结果证实，miRT44在肿瘤组织比癌旁正常组织中的表达量降低，并且在构建肝癌皮下种植裸鼠模型中，也发现miRT44在肝癌内表达量显著降低。这表明miRT44对肝癌有相关调控作用。
HGF具有多种生物学功能，常通过自分泌或旁分泌的形式作用于包括肿瘤细胞在内的多种上皮细胞，能刺激肝细胞DNA的合成，促进肝再生，同时还能促进肝癌细胞增殖、运动及血管形成〔7。尤其在肝癌切除术后,HGF分泌活跃，诱导特异性跨膜受体e-Mct过量表达，促使了肝癌复发，因此抑制HGF/c-met信号传导通路对减少肝癌复发及转移发挥着重要作用〔7〕。研究发现，HGF可以激活Bcl-0基因表达、下调Bax蛋白活性，发挥抗细胞凋亡的作用〔⑶。HGF还可通过刺激血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP- T及e-Mct在血管内皮细胞中的表达，促进肿瘤新生血管形成。HGF/1-Mct信号转导通路在人体内正常细胞向恶性细胞转化过程中发挥重要作用〔"⑸。在致癌性转化过程中Met活性调节可能与正常的e-Mct活性调节完全不同。研究发现,Met基因缺失的小鼠表现为因肝脏和胎盘发育严重缺陷导致胚胎致死，其特点与小鼠HGF基因缺失表现十分相似。HGF/c-MW信号通路可以在多个胚胎组织中调节形态发生和浸润性生长〔⑹。本研究结果说明miRT44能够抑制HGF的表达量并抑制肝癌细胞的增殖，这预示miRT44能够通过抑制HGF的表达，从而抑制肝癌的发展。
综上所述,miRT44可抑制肝癌细胞MHCC97H 的增殖，迁移和细胞周期在2期聚集，而这些抑制效果可被HGF补回，而miRT44能够抑制HGF的表达并抑制肝癌细胞的增殖，对肝癌有抑制效果。
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韩芬等 miRR94通过调控KLF 〕表达降低缺氧诱导的心肌细胞损伤 第〕期
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[2519-65-01 修回〕
(编辑王一涵)
miRD74通过调控KLF15表达降低缺氧诱导的心肌细胞损伤
韩芬7杨晓2
（1郑州铁路职业技术学院药学院基础医学教研室，河南 郑州450000；2河南中医药大学第一附属医院耳
鼻喉科）
〔摘要〕目的探讨miRD94对缺氧诱导的心肌细胞损伤的影响及其分子机制。方法建立心肌细胞缺氧组，缺氧 条件为37C 、95%N 5+5%CO 5处理43 h，不作任何处理的细胞作为对照（Cootul ）组；设置miR-coo 组（转染miR-cou ）、miRE94 组（转染 miR-（44 mimics （、a/ti-miR2oo 组（转染 a/V-miR-coo ） >a//-miR-（94 组（转染 a//-miDD44）、pcDNA 组（转染 pcDNA ）
和 pcDNARLF
〕组（转染 pcDNARLF
〕
）；再将 a/V-miR-coo 组、anti-miRE94 组、pcDNA 组和 pcDNARLF
〕组细胞进行缺氧
处理，记为缺氧+ a/V-miR-coo 组、缺氧+ an/-miRD94组、缺氧+pcDNA 组和缺氧+ pcDNA-KLF
〕
组；将miRD94质粒分别和
pcDNA 、pcDNARLF
〕质粒共转染到正常培养的心肌细胞中再作缺氧处理，分别记为缺氧+miRE94+pcDNA 组和缺氧+miR-
34+pcDNARLF
〕
组；将an/-miRD94质粒分别和W-coo 质粒、WRLF
〕质粒共转染到正常培养的心肌细胞中再做缺氧处理,
分别记为缺氧+a //-miRE94 + WROo 组和缺氧+a//-miRE94 + W-KLF
〕
组，转染均采用脂质体法。qRTRCR 检测细胞中miR-
144 和KLF15 mRNA 水平;Western 印迹检测蛋白表达水平；噻唑蓝（MTT ）法检测细胞存活率；流式细胞术检测细胞凋亡；双荧
光素酶报告基因实验检测荧光活性。结果 缺氧处理的心肌细胞中miRE94高表达.KLF15低表达，缺氧处理抑制心肌细胞
存活，诱导细胞凋亡。抑制miRE44表达和过表达KLF15促进缺氧处理的心肌细胞存活并抑制细胞凋亡;mUD94靶向负调
控KLF15的表达。沉默KLF15部分逆转miRE94抑制表达对缺氧处理心肌细胞的保护作用；过表达KLF15部分逆转miRE44
过表达对缺氧处理心肌细胞中yRTAT3蛋白表达的促进作用。结论 抑制miRE94表达能降低缺氧诱导的心肌细胞损伤，其 机制可能与调控KLF15及pRTAT3蛋白的表达相关，为心肌细胞损伤的提供新靶点。
〔关键词〕miRE94;KLF 〕；缺氧；心肌细胞损伤；凋亡
〔中图分类号〕R744.9 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1005-4200 （2001） 10-4105L2:doi : 10. 3962/j. issn. 1005-4200. 4001.10. 049
急性心肌梗死严重威胁着人类健康及生活质
量，而心肌组织缺血缺氧导致的心肌细胞坏死凋亡
是重要原因〔〕°缺氧在多种肿瘤细胞增殖与凋亡、
新生血管形成、侵袭与转移等生物学行为的改变中 发挥重要作用,miRNA 是一类长度为3 ~24 /的非
编码RNA，调控其靶mRNA 的翻译和表达可以改变 缺氧诱导肿瘤生物学行为〔〕°研究发现miR-179通
过下调c-myb 增强缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞 凋亡〔〕；过表达miRRObl 可抑制缺氧诱导的心肌细 胞凋亡⑷。而miRD94可抑制喉鳞状细胞癌增
殖t 73 ,miR-179通过调节鼠双微粒体基因（MDM -R 表达调节卵巢癌细胞中的紫杉醇抗性〔〕，但miR-第一作者：韩芬（37/2，女，硕士，副教授，主要从事心血管疾病病理
及药物防治研究。
39对缺氧的心肌细胞的影响还尚未见报道° KLFs 属于锌指转录因子亚家族，参与早期的胚胎生长发
育、细胞分化、组织器官的形成、原癌基因的突变和 血管生成等生理病理过程,KLF 〕是KLF 家族的重 要成员，具有同样的功能〔〕°而KLF17在缺氧诱导
的心肌细胞凋亡中作用尚不清楚，且miRD94与 KLF17之间的调控关系也不清楚，本研究旨在探讨
miRD94对缺氧诱导的心肌细胞损伤的影响及其可
能作用的分子机制是否与KLF17有关，为心肌细胞 损伤及其导致的相关疾病提供新靶点和新
方向°
1材料和方法
11材料 心肌细胞H9C2购自中国科学院上海
细胞库；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM 培养液购自
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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