利用STTM技术分析拟南芥miR160和miR165/166的互作网络及玉米miR166的初步功能
MicroRNA(微miRNA,miRNA)是一类非编码小RNA,在植物生长发育和逆境胁迫响应中起到重要作用。Short Tandem Target Mimic(短串联靶标模拟,STTM)技术能够高效、特异沉默目标miRNA家族,而其他miRNAs的表达和功能则不受影响,在miRNA的作用机制和miRNA间的互作网络研究中发挥着巨大的功效。本研究利用STTM技术分析拟南芥miR160和miR165/166的互作网络,以及玉米miR166的作用机制。 为了鉴定拟南芥中miR160和miR165/166的互作网络,通过两个单突变体STTM160和STTM165/166的杂交,获得了双突变体STTM160×165/166,鉴定了双突变体的叶片发育和干旱胁迫的表型转变,分析了miR160和miR165/166及其靶基因的表达水平。利用转录组和小RNA测序技术,比较了单、双突变体中miRNA和基因的表达差异。利用高性能液相谱(HPLC)技术,比较了单、双突变体中IAA和ABA的相对含量,阐明了miR160和miR165/166互作对叶片发育和干旱耐性的影响。 此外,为了验证玉米中miR166的作用机制,通过构建表达载体,并进行遗传转化,获得了转基因STTM166,鉴定了STTM166植株和穗粒的表型,分析了miR166的表达水平。利用转录组测序
mirna靶基因分析技术,比较了转基因STTM166与野生型C01基因的表达差异,阐释了miR166调控玉米叶片发育和开花时间的潜在作用机制。本研究的主要结果如下:1、STTM160的叶片上翻,边缘锯齿,开花时间提前;STTM165/166的叶片数目增多,颜加深,向内卷曲呈勺子状或喇叭状,干旱耐性较强。
双突变体STTM160×165/166则表现出综合减弱的表型,叶片数目增多,表面粗糙,略微上翻,边缘稍有锯齿,开花略微提前,干旱耐性稍有增强。与野生型(Col-0)相比,STTM160×165/166中小RNA miR160和miR165/166的表达量明显下调,而靶基因ARF10、ARF16、PHB、PHV的表达量明显上调。与两个单突变体(STTM160和STTM165/166)相比,STTM160×165/166中miR160下调表达,miR165/166上调表达,ARF10和ARF16上调表达,PHB和PHV下调表达。
双突变体表型和miRNA、靶基因表达的转变表明,miR165/166和miR160之间存在互作。2、利用RNA-seq和small RNA-seq技术,对两个单突变体(STTM160和STTM165/166)与双突变体(STTM160×165/166)进行分析。结果显示,与STTM160相比,STTM160×165/166中鉴定到7个差异表达miRNA和728个差异表达基因。
与STTM165/166相比,STTM160×165/166中鉴定到22个差异表达miRNA和4732个差异表达基因。这些差异表达miRNA和基因参与的代谢途径主要包括:光合作用,昼夜节律,植物激素信号转导,生物及非生物胁迫响应等。这表明miR165/166与miR160之间的互作可能是通过这些途径相关的miRNA和基因实现的。
3、由于叶片形态缺陷可能与叶片发育关键miRNA有关,干旱耐性改变可能与植物激素关键基因有关,进而比较了两个单突变体(STTM160和STTM165/166)与双突变体(STTM160×165/166)之间相关miRNA和基因的表达差异。结果显示,与STTM160和STTM165/166相比,STTM160×165/166中miR159和miR319表达水平最高,miR156、miR164、miR390和miR396的表达水平高于STTM160但是低于STTM165/166。与STTM160和STTM165/166相比,STTM160×165/166中TAA1、YUC1、PYR1和BG1的差异显著。
由于IAA和ABA信号相关基因的改变可能会导致IAA和ABA内源含量的改变,运用高性能液相谱(HPLC)方法,测定了野生型Col-0、单突变体STTM160和STTM165/166与双突变体STTM160×165/166之间IAA和ABA的相对含量。结果显示,STTM160×165/166中IAA和ABA
的含量高于STTM160和Col-0却低于STTM165/166,且差异达到显著水平。4、玉米STTM166的植株出现叶片卷曲,开花延迟,株高降低,雄穗长度、雄穗分枝数减少等现象。
STTM166的果穗出现穗长变短,穗粗、穗行数、行粒数基本不变等现象。与C01相比,STTM166的粒长为6.50 mm,减少1.98 mm,差异达到极显著水平。STTM166的百粒重为13.20 g,减少5.5 g,差异达到极显著水平。
STTM166的百粒重明显降低,降幅为29.41%,可能与粒长的明显减少有关。这表明miR166的功能在单子叶和双子叶植物中存在保守性。5、运用RNA-seq技术,对转基因STTM166与野生型C01进行分析,共鉴定到178个差异表达基因,包含118个上调基因和60个下调基因。
这些差异表达基因不仅包括miR166的靶基因,而且还有玉米开花期的直接调控基因ZCN8,花器发育关键基因MADS-Box,叶片卷曲关键调控基因RLD2,KAN1和KAN3等。这些基因的改变是miR166沉默导致玉米叶片卷曲、开花延迟的可能原因。
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