第39卷第2期2021年4月
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Agricultural University
科学新闻
doi:10.16036/j.issn.1000-2650.2021.02.001
李燕，王贺，朱勇，张凌荔，鲁均华，王文明*
(四川农业大学西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室，成都611130)
摘要：【目的】作物产量、生育期和抗性是生产中的3个关键因素。提高抗性往往影响产量，而高产往往伴随更长的生育期。
发掘能协调这3个因素的基因，对作物高产抗病研究和育种具有重大意义。【方法】利用遗传、生化和植物病理学等技术手段，对水稻miR168调控水稻产量、生育期和抗性的功能和相关机制进行了分析。 【结果】过表达miR168导致稻瘟病抗性降低，植株变高，分蘖减少，产量降低，开花延迟；而表达miR168的一个模拟靶标(targetmimic,MIM168)从而抑制miR168 的功能后，稻瘟病抗性增强，植株变矮，分藥和产量增加，花期提前。发现miR168影响整个miRNA网络，通过miR1320调控稻瘟病抗性，通过miR535平衡分蘖发育和稻瘟病抗性，通过miR164控制开花时间和稻瘟病抗性。相关研究成果以"
Suppression of rice miR168improves yield，flowering time and immunity"为题于2021年2月发表在国际期刊Nature Plants (/10.1038/s41477-021-00852-x)。【结论】成果揭示了单个miRNA可协同调控水稻产量、生育期和稻瘟病抗性。相关研究成果为水稻高产高抗病育种提供了备选基因资源。
关键词：水稻；miR168；AGO1；稻瘟病抗性；产量；生长周期
中图分类号：S435.111.1文献标志码：A文章编号：1000-2650(2021)02-0137-04
Suppression of Rice miR168Improves Yield,
Flowering Time and Immunity
LIYan,WANG He,ZHUYong,ZHANG Lingli,LUJunhua,WANG Wenming*
(State Key Laboratory of Crop Gene Exploration and Utilization in Southwest China,
Sichuan Agricultural University,Chengdu611130,China)
Abstract:【0bjective】Yield,flowering time,and disease resistance are key factors in rice production.
However,the presence of disease resistance gene can penalize crop yield.Looking for genes that can coordinate the three factors is helpful for rice immunity research and breeding.[Method】We adopt various techniques in genetics,biochemistry,and plant pathology to dissect the function and mechanism of miR168in rice yield,growth period and blast disease resistance.【Result l Our results demonstrate that suppression of miR168by a target mimic(MIM168)not only improves grain yield and shortens flowering time in rice,but also enhances immunity ae.These results were validated through repeated tests in rice fields in the absence and presence of rice blast pressure.We found that miR168-A GO1 module regulates miR535to improve yield by increasing panicle number,miR164to reduce flowering time,and miR1320and miR164to enhance immunity.The related results were Published on Nature Plants in February,2021with the title“Suppression of rice miR168improves yield,flowering time and /10.1038/s41477-021-00852-x).[Conclusion】Our discovery demonstrated that changes in a single miRNA enhance the expression of multiple agronomically important traits.
Keywords:rice；miR168；AGO1；blast disease resistance；yield；growth period
收稿日期：2021-03-24
基金项目：国家自然科学基金项目(U19A2033.31672090和31430072)；NIH基金项目(GM59962)；USDA NIFA基金项目(2017-67013-26590)；Joint BioEnergy Institute基金项目(DE-AC02-05CH11231)o
作者简介：李燕，副教授，主要从事水稻抗病机制及应用研究,E-mail:****************o*责任作者：王文明，教授，主要从事水稻抗病机制与应用研究,E-mail：*************************。
138四川农业大学学报第39卷
水稻是全球最重要的粮食作物之一。产量、生育期和抗性是水稻生产中的3个关键因素。然而，抗性与产量之间往往存在拮抗作用，免疫激活和抗病性的提高，常常以牺牲产量为代价，成为抗病种质创新的一个瓶颈问题［1-2］o同时，产量和生育期之间也存在平衡关系，高产的种质资源往往具有较长的全生育期X，不利于农业生产的高效节能。目前，还没有单一基因可同时增产、增抗并缩短生育期的相关报道。寻能同时协调上述三要素的基因，可为水稻高产抗病研究提供新的理论基础和备选基因资源。
MicroRNA(miRNA)是生物体内源的长度约为19~24个碱基的单链RNA，与Argonaute(AGO)蛋白结合，
形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，结合到与miRNA反向互补的DNA或RNA上，通过介导DNA甲基化修饰,RNA切割，以及阻断mRNA翻译等，调控基因表达。miRNA全方位控制植物的生长，发育和免疫冋。我们在前期研究中发现,Osa-miR168 (miR168)受稻瘟菌侵染诱导，而miR168的靶标基因编码了RISC的关键组成蛋白AGO1(AGO1a, AGO1b,AGO1c,AGO1d)。但是，miR168如何通过AGO1调节稻瘟病抗性，以及如何影响水稻生长发育尚不清楚。
为了进一步研究miR168在稻瘟病抗性中的作用，我们构建了过表达miR168的转基因材料0X168，以及抑制miR168功能的转基因材料MIM168。OX168材料中miR168累积显著增加，AG01表达水平显著降低；反之,MIM168材料中miR168累积减少,AG01表达增加。农艺性状分析显示，与对照相比,0X168株高增加，有效分蘖显著减少，千粒重有所增加；相反，MIM168株高降低，有效分蘖显著增加，千粒重有所降低。另外,0X168的营养生长期延长，花期延迟，籽粒晚熟；而MIM168营养生长期缩短，花期提前，籽粒早熟。这些结果说明，改变miR168在水稻中的累积，可以影响水稻的农艺性状和生育期，并可能影响产量。进一步连续3年的大田产量分析结果显示，在水稻正常生长季节，与对照相比，MIM168增产30%~40%，但0X168减产20%~40%o这一结果证明，抑制miR168的功能，可以有效提高水稻产量。 我们的前期研究结果显示,miR168响应稻瘟菌侵染叫病圃抗性压力实验结果显示，与正常大田种植材料相比，对照材料减产约13%,MIM168材料减产仅4%左右，与对照相比增产最高达75%，而0X168则
减产20%~40%，说明抑制miR168的功能，可以提高稻瘟病抗性和保障增产。我们进一步在实验室内分析了转基因材料对3个不同来源的稻瘟菌株(国际通用菌株，中国北方和南方大田分离菌株)的抗性反应。与大田实验结果一致，与对照相比,MIM168对这3个菌株的抗病性均增强，侵染部位的病斑面积减小，菌量减少，而0X168则呈现相反的表型。另外,0X168材料上稻瘟菌的侵染进程显著加快，侵染部位H2O2累积减少,H2O2合成相关基因和抗性相关基因的表达水平也显著降低；相反，MIM168材料中稻瘟菌的侵染进程显著延迟, H2O2累积增加，相关基因的诱导水平也显著提高。这些结果证明，miR168削弱稻瘟病抗性，而抑制miR168的功能可以增强稻瘟病抗性。
为了明确miR168是否通过AG01来调控水稻生长发育和抗性，我们构建了沉默AG01的转基因材料(AG01i),AG01的表达在转基因材料中被显著抑制。与0X168材料的表型一致,AG01i株高增加，籽粒变大，有效分蘖减少，产量显著降低；同时, AG01i对稻瘟菌的感病性也显著增加，稻瘟菌的侵染进程加快，侵染部位H2O2的累积也显著减少，暗示miR168通过AG01调控水稻生长和抗性。
我们接下来分析miR168-AGO1模块通过哪些下游信号通路调控水稻生长和抗性。因为miR168-AGO1模块调控整个miRNA网络，我们分别在水稻苗期和分蘖期收集水稻叶片，在孕穗期收集幼穗，提取RNA，进行小RNA高通量测序分析。结果显示，与对照水稻材料相比，很多miRNA的累积在0X168和MIM168中都发生了显著的改变。进一步分析发现，苗期有162个，分蘖期有156个，抽穗期有197个miRNA的表达受miR168影响。在这些被调控的miRNA中，15个miRNA已被报道参与调控水稻的生长
发育〔碎叫同时，通过与我们原来发表的数据进行交叉比对叫筛选出了54个既受miR168影响，又响应稻瘟菌侵染的miRNAo在这些miRNA 中，有9个已经被验证参与调控稻瘟病抗性［5,7」1-16］。与此相呼应，与对照材料相比，这些miRNA靶基因的表达水平在0X168和MIM168材料中也有变化。这些结果暗示,miR168-AGO1模块可能通过调控下游的miRNA累积来影响水稻生长和抗性，并且，应该有部分miRNA起关键作用。
进一步筛选可能起关键调控功能的miRNA发现，在苗期和分蘖期叶片中,miR1320的累积量在MIM168中增加，在0X168中降低。另外，在稻瘟菌
第2期李燕，等：通过抑制水稻miR168改良产量、抗性和生育期139
侵染条件下,miR1320的累积在抗性材料IRBLkm-Ts中增加，而在感病材料LTH中降低，暗示miR1320参与了miR168对稻瘟病抗性的调控。为了验证这一猜想，我们分别构建了野生型背景下的miR1320的过表达材料（0X1320），抑制miR1320功能的转基因材料（MIM1320），以及在0X168和MIM168背景下的过表达材料（OX1320/OX168和0X1320/MIM168）。我们对上述材料进行抗性分析发现，OX1320材料稻瘟病抗性显著增强，稻瘟菌侵染进程延迟，H2O2累积和抗性相关基因的表达水平也显著提高，而MIM1320则呈现相反的表型。另外，OX1320/OX168材料的抗性显著高于OX168材料，而OX1320/MIM168抗性也显著高于MIM168。有意思的是，OX1320虽然抗性增强，但产量与对照相比无显著差异。这些结果说明,miR1320参与了对稻瘟病抗性的调控，但不影响产量。mirna靶基因分析
miR156,miR529和miR535都靶定SQUAMOSA promoter binding protein-like（SPL）14。SPL14编码一个调控水稻理想株型的蛋白IPA1，抑制水稻分蘖，但促进穗发育[8'17-18]o我们检测了这些miRNA在OX168和MIM168材料分蘖期的茎端分生组织中的累积量°miR156的累积无显著变化,miR529的累积量低于检测阈值。然而，在分蘖早期,miR535的累积在OX168中降低，在MIM168中增加；到了分蘖后期，miR535的累积在OX168和MIM168中均降低。与miR535的累积模式相反，在MIM168的茎端分生组织中，靶基因SPL14的表达在分蘖早期被抑制，在分蘖后期则被上调。这些结果暗示,miR168-AGO1模块可能通过miR535调控分蘖和穗发育。
为了进一步检测miR535在miR168-AGO1模块调控分蘖的信号通路中的作用，我们分别构建了野生型背景下的miR535的过表达材料（OX535），抑制miR535功能的转基因材料（MIM535），以及在OX168和MIM168背景下的过表达材料（OX535/ OX168和OX535/MIM168）。SPL14的表达水平在OX535材料中被显著抑制，反之，在MIM535材料中显著提高，说明miR535能有效抑制SPL14的表达。OX535材料的分蘖数达到对照的2~3倍，但穗型变小，结实率下降；相反,MIM535材料的分蘖数与对照相比无显著差异，但穗型变大，每穗粒数增加，导致单株产量增加。与此一致,OX535/OX168和OX535/MIM168材料的分蘖数都显著高于其各自的背景材料OX168和MIM168。另外,MIM535抗性增强，而OX535抗性减弱。这些结果暗示，在苗期到分蘖早期的转变过程中，MIM168材料中miR535的累积增加，抑制SPL14的表达，从而促进分蘖，但影响抗性；而进入分蘖后期时,miR535累积减少，SPL14表达增加，从而抑制无效分蘖的形成，促进穗发育，并提高抗性。
我们也筛选了可能影响生育期的miRNAo测序数据显示，在抽穗期，与对照材料相比,miR164在MIM168材料中的累积降低，而在OX168中无显著差异。相反,miR164的靶基因NAC11，被报道可促进早花凹，在MIM168材料中的表达显著增加，暗示在MIM168中,miR164在抽穗期的低累积促进了NAC11的表达，从而促进早花。为了进一步检测miR164是否真的参与miR168-AGO1模块调控生育期的信号通路，我们分别构建了野生型背景下的miR164过表达材料（OX164），抑制miR164功能的转基因材料（MIM164），以及在OX168和MIM168背景下的过表达材料（OX164/OX168和OX164/ MIM168）。与对照相比,OX164材料株型变矮，花期延迟4d左右,NAC11的表达水平显著降低；与MIM168相比，OX164/MIM168花期也延迟3d左右；相反,MIM164材料株型基本不变，花期提前5d 左右,NAC11和开花相关基因Hd3a和RFT1的表达水平也显著提高。另外，我们还构建了NAC11的两个突变体nac11-1和nac11-2，发现这两个突变体的花期均比对照有所延迟。这些结果说明,miR164-NAC11模块参与了miR168-AGO1模块调控的水稻生育期。
同时，在苗期和抽穗期，miR164的累积在OX168中增加，而在MIM168中有所降低。与此相吻合,OX164材料的稻瘟病抗性降低，而MIM164材料的抗性增强；OX164/OX168材料的抗性显著低于OX168，而OX164/MIM168的抗性也显著低于MIM168o这些结果说明,miR164也参与了miR168-AGO1模块调控的水稻稻瘟病抗性。
作物产量与全生育期密切相关，与抗性之间也存在拮抗关系。在这一研究中，我们发现抑制miR168的
功能，可以提高水稻产量，促进早花，并提高稻瘟病抗性。miR168-AGO1模块影响了整个miRNA网络。其中，通过miR1320提高稻瘟病抗性，通过miR535调控分蘖、穗发育和抗性，通过miR164控制花期和抗性（图1）。需要指出，应该还有受miR168-AGO1模块调控的其他很多miRNA 也参与调控水稻产量、生育期以及抗性，这些miRNA的具体功能有待进一步研究。
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图1miR168-AGO1s模块通过3个miRNA调控水稻免
疫和生长发育的模式图
Figure1Model for miR168-AGO1s regulating rice immunity and growth through three miRNAs
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