mirna靶基因分析
具核梭杆菌通过调控miR-181b在结肠癌细胞中形成炎性微环境的机制 研究背景:具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)是口腔常见致病菌,但近年来研究发现,该菌与结直肠癌的发生发展密切相关。Fn是一种具有侵袭性,黏附性的厌氧菌,同时它也具有促炎性因子释放以及调节肿瘤免疫微环境的能力。 Fn如何通过炎性因子致结直肠癌的发生发展,当中机制尚不明确。研究表明,当肠上皮细胞受到Fn感染时,炎性因子表达增高,但尚无相关文献从miRNAs的角度研究由此引起的炎性因子表达上调的相关机制。 目的:通过构建Fn感染Caco-2细胞的炎症模型,运用miRNA测序技术分析由此所引起miRNAs基因表达差异;通过生物信息学的方法筛选出表达差异显著的miRNA及其下游靶基因,并对其调控靶基因的机制及引起的生物学效应进行研究,从而初步探索得到Fn感染在促炎症信号通路上相关结直肠癌发生发展的作用机制。方法:1.构建了Fn感染Caco-2细胞的炎症模型,运用miRNA测序技术分析由此所引起miRNAs表达差异;2.通过qPCR、ELISA、WesternBlot等方法对模型中TNF-α在转录水平及蛋白水平上的变化进行检测;3.使用Transwell实验分析Fn与Caco-2细胞共培养后诱导产生的趋化因子及其引起的生物学效应;4.采用qPCR方法验证模型
中表达差异显著的miR-181b的表达情况;5.通过转染的手段,分别上调及下调Caco-2细胞中miR-181b,再加入Fn感染处理,由此研究在Fn介导下miR-181b与TNF-α之间的相关关系;6.采用生物信息学工具及双荧光素酶检测方法证实miR-181b与TNF-α的靶标关系。
结果:1.miRNA测序结果分析显示,Fn感染Caco-2细胞引起的相关差异miRNA有653个,其中在处理组中低表达645个,高表达8个,其中,miR-181b表达显著降低(p=0.001345),主要涉及炎症、增殖、细胞凋亡等多个信号通路的变化。2.构建Fn感染Caco-2细胞模型作为处理组(MOI=200:1,共培养6h),采用qPCR、ELISA、WesternBlot检测TNF-α在mRNA及蛋白水平上的表达变化,结果显示Fn感染后无论在转录水平还是蛋白水平,处理组中TNF-α的表达均比对照组显著升高,证明建模成功。
3.收集Fn与Caco-2细胞共培养6小时后的培养液上清作为趋化因子,采用Transwell的方法,观察其对淋巴细胞的趋化作用,发现淋巴细胞穿膜数量明显增多(p=0.0445)。4.采用qPCR对miRNA测序结果进行验证,结果显示处理组中miR-181b表达稳定下调,与测序结果相符(p=0.0078)。
5.采用转染的手段,转入miR-181binhibitor,通过qPCR、ELISA、WesternBlot等方法检测TN
F-α表达的变化,发现miR-181b受到抑制后,TNF-α的表达上调;另一方面,将Caco-2细胞中miR-181b过表达后,加入Fn感染处理,发现TNF-α仍然表达下调。6.采用targetscan等miRNA靶基因预测网站到miR-181b-5p与TNF-α3’UTR的结合位点,以双荧光素酶检测(luciferaseAssay)、qPCR、ELISA、WesternBlot等方法,并证实miR-181b与TNF-α靶标关系。
7.取Fn与miR-181b过表达的Caco-2细胞共培养的上清液,通过Transwell细胞趋化实验观察培养上清对人淋巴细胞的招募作用,发现miR-181bmimics组淋巴细胞穿膜数量降低(p<0.0001)。结论:1.Fn感染Caco-2细胞抑制miR-181b的表达。
2.TNF-α是miR-181b的靶基因。3.Fn通过在结肠癌细胞中下调miR-181b释放TNF-α招募淋巴细胞形成炎性微环境。
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