DOI: 10.11829/j.issn.1001-0629.2020-0639
mirna靶
基因分析
韩佳婷，冯光燕，帅杨，焦永娟，张新全. 植物miR156及靶基因SPL家族的研究进展. 草业科学, 2021, 38(5): 890-902.HAN J T, FENG G Y, SHUAI Y, JIAO Y J, ZHANG X Q. Advances in research of miRNA156 and targeted SPL gene in plants. Pratacultural Science, 2021, 38(5): 890-902.
植物miR156及靶基因SPL家族的研究进展
韩佳婷，冯光燕，帅 杨，焦永娟，张新全
（四川农业大学草业科技学院，四川 成都 611130）
摘要：SPL (SQUAMOSA promoter binding protein-like)是绿植物所特有的一类转录因子，其部分家族成员含有miR156结合位点，在转录水平上受miR156负调控。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)等模式植物中，miR156-SPL不仅参与植物的开花调控，同时具有介导植物生育阶段转变、调节植物次生代谢、参与植物光信号转导和胁迫响应等作用。随着生物技术的发展，关于植物中miR156-SPL的研究越来越多，本研究重点阐述miR156-SPL模块在调控植物开花、株型结构、果实发育、胁迫响应等方面的作用及其机制，为进一步探索miR156-SPL模块在草类植物中的功能奠定基础。 关键词：miR156-SPL；开花；分蘖；抗逆；草类植物
文献标志码：A 文章编号：1001-0629(2021)05-0890-13
Advances in research of miRNA156 and targeted SPL gene in plants
HAN Jiating, FENG Guangyan, SHUAI Yang, JIAO Yongjuan, ZHANG Xinquan
(Sichuan Agricultural University College of Grassland Science and Technology, Chengdu 611130, Sic
huan, China ) Abstract: The SQUAMOSA promoter binding protein-like (SPL) gene family is a class of transcription factors unique to green plants. The majority of the members of the SPL family contain miR156 binding sites and can be negatively regulated by miR156 at the transcriptional level. Studies on Arabidopsis thaliana, Oryza sativa and other model plants have shwon that miR156-SPL is involved in flowering regulation, morphology transition, secondary metabolism, light signal transduction and stress response. With the development of biotechnology, increasing studies on the role of miR156-SPL in plants have been reported. This review summarizes the various functions and molecular mechanisms of miR156-SPL, and aims to lay a foundation for further exploration and application of miR156-SPL in grass.
Keywords: miR156-SPL; flowering; tillering; stress resistance; grass
Corresponding author: ZHANG Xinquan E-mail: *****************
开花是大多数高等植物由营养生长向生殖生长
转变的关键点，是植物繁衍后代的重要阶段[1]。开
花过程受复杂的外部环境刺激和内在基因调控的
诱导因素之一[2-3]。金鱼草(Antirrhinum majus)花分
生组织特征基因SQUAMOSA (SQUA)与拟南芥
(Arabidopsis thaliana)的花分生组织特征基因AP1
(APETALA1)同源，均为MADS-box转录因子家族成
员，是最早发现的具有调控植物开花功能的基因之
一[3-6]。1992年，Klein等[4]将SQUA基因作为研究花
收稿日期：2020-11-25 接受日期：2021-03-10
基金项目：国家自然科学基金(NSFC 31872997)；国家现代牧草产业技术体系(CARS-34)
第一作者：韩佳婷(1995-)，女，河北张家口人，在读硕士生，研究方向为草种质资源创新及育种研究。E-mail: **********************
通信作者：张新全(1965-)，男，四川眉山人，教授，博导，博士，研究方向为草种质资源创新与育种。E-mail: *****************
890-902草 业 科 学第 38 卷第 5 期5/2021PRATACULTURAL SCIENCE Vol.38, No.5
形成过程分子调控网络的起点，发现金鱼草SQUA 突变体株系的苞片过多、花畸形或不完整，认为SQUA具有控制花形态发生的作用。Huijser等[5]发现金鱼草中的两个成员(SBP1和SBP2)可以与SQUA基因启动子相互作用，并通过影响SQUA的表达参与花的早期发育调控。随后在拟南芥、水稻(Oryza sativa)、番茄(Solanum lycopersicum)等多个物种中均鉴定到SPL家族(即SBP家族)的存在，发现其具有改变叶片形状、调控分蘖或分枝、参与果实形态建成及成熟过程等作用[7-9]。而众多的研究表明，SPL家族能被miR156负调控从而影响植物开花。
MiR156最先发现于拟南芥[10]，由约20个核苷酸组成，结构保守，通过靶向SPL家族参与植物表型改变和开花调控过程[7, 11]。SPL家族中部分成员3' UTR区和CDS区包含miR156识别位点，且不同物种受miR156调控的SPL数量存在差异(表1)。MiR156识别SPL后可以通过剪切降解方式抑制SPL的表达[17]。研究者[9, 18]分别通过在番茄中对miR156进行过表达和烟草(Nicotiana tabacum)中瞬时转化证明了miR156对SPL13的转录后调控作用。将拟南芥SPL3中miR156识别位点突变后，转基因植株中检测到SPL3蛋白；而正常过表达SPL3时，虽然其转录水平显著提高，但并未检测到SPL3蛋白的存在，
说明miR156还可以通过抑制翻译的方式负调控SPL的表达水平[19]。近年研究发现，miR156-SPL互作具有调控植物开花、改变植物相关表型特征、提高籽粒产量、响应生物和非生物胁迫等多种生物学功能，且这些功能的研究多集中于模式植物拟南芥和水稻中[7, 15, 20-21]。本研究重点阐述miR156-SPL模块调控植物开花、株型结构、果实发育、胁迫响应的作用及其分子调控网络，并结合草类植物miR156-SPL的研究进展，为分子育种提供理论依据。
表 1 不同物种SPL家族成员数量
Table 1 Number of SPL family members in different species
物种Species
SPL家族成员数量
Number of SPL family genes
miR156靶基因数量
Number of genes targeted by miR156
参考文献
Reference
拟南芥 Arabidopsis thaliana1711[12]柳枝稷 Panicum virgatum3521[13]水稻 Oryza sativa1911[14]番茄 Solanum lycopersicum177[9]柽柳 Tamarix chinensis146[15]葡萄 Vitis vinifera1812[16]
1 MiR156-SPL调控植物开花
开花植物的成花过程包括开花诱导、花原基形成及花器官发育3个阶段。其中，开花诱导的调控网络复杂且精细，受多种因素影响。根据内源信号和环境刺激可将开花诱导途径分为光周期途径[22]、春化途径[23]、赤霉素途径[24]、自主途径[25]以及年龄途径[11]。高等植物中的年龄途径是一种非诱导条件下的开花调控途径。目前的研究表明，miR156-SPL 模块是该途径中的主要调控因子，其中miR156和SPL呈现相反的表达模式，即miR156可维持植物幼年形态特征，而SPL则促进植物开花[7, 11]。对miR156-SPL上游调控信号研究表明，糖信号和CO2浓度在一定程度上影响miR156-SPL的表达模式[26-27]。植物生长发育进程中，光合作用产生的糖积累以及环境中CO2浓度的升高均会降低miR156的表达水平[1, 26-28]。Yang等[26]的研究发现，葡萄糖和果糖可以抑制拟南芥miR156的积累，并通过“脱叶补糖法”证实了这一观点；Yu等[28]发现拟南芥中的糖类可以通过降解miR156的初级转录本来抑制miR156的表达。近期，Zhou等[29]进一步研究糖信号和年龄途径对miR156的调控时发现，NUCLEAR FACTOR Y A8(NF-YA8)可直接结合miR156启动子CCAAT 顺式作用元件，通过整合糖信号
和年龄途径来调控miR156的表达，从而参与植物的营养阶段转变和开花过程。Guo等[30]进一步研究发现MYB33可结合
第 5 期韩佳婷 等：植物miR156及靶基因SPL家族的研究进展891
miR156A和miR156C的启动子促进其转录，而miR159通过抑制MYB33从而下调miR156的表达。May等[27]利用转录组测序揭示了高浓度CO2会降低拟南芥miR156的表达水平，并参与miR156/157-SPL s-miR172-AP2-like通路介导的开花调控网络，引导植物的成花转变。此外，当拟南芥幼苗光形态发生正调控因子HY5 (LONG HYPOCOTYL 5)突变后，miR156的表达显著降低[31]；缺磷情况下，拟南芥中miR156表达上调[32]，表明miR156的表达可能受光信号和养分供给等多种因素的影响[31-32]。
目前，研究发现miR156-SPL模块主要通过调控下游相关开花基因影响植物开花过程(图1)。在拟南芥的茎顶端，AtSPL3/4/5和AtSPL9可以直接激活下游LEAFY (LFY)、FRUITFULL (FUL)、AGAMOUS-LIKE (AGL42)和AP1等MADS-box基因从而促进开花[38]。在拟南芥的叶片中，AtSPL9通过激活miR172降低下游AP2-like开花抑制基因的表达水平，形成miR156/157-SPL s-miR172-AP2-like调控通路，从而促进开花[12, 39]，表明植物在不依赖外界环境的情况下依然可以进入生殖阶段。此外，赤霉素途径中的转录抑制因子DELLA蛋白可以通过与miR156的靶基因SPL互作来降低SPL的活性。一方面，通过降低下游MADS-box开花基因表达水平，引起短日照下延迟开花；另一方面，通过miR172-A
P2-like途径，抑制开花基因FT的表达，导致长日照下开花延迟[33]；同时，Hyun等[40]发现，拟南芥AtSPL15还依赖GA信号招募MED18和RNA polymerase II，引导下游FUL和miR172b参与开花过程。除参与植物年龄调控外，miR156-SPL还响应植物的春化过程。AP2-like家族中的TOE1基因表达导致弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)对低温不敏感，无法正常春化开花。TOE1受miR156正向调控，TOE1和miR156表达随植物生长过程的推进而降低，从而提高弯曲碎米荠的低温敏感性，诱导开花[41]，表明miR156-SPL 不仅是年龄调控开花途径中的重要因子，同时还通过整合GA途径和春化途径协同调控植物开花过程。
图 1 MiR156-SPL参与开花、分蘖和果实发育的调控机制
Figure 1 The regulatory mechanism of miR156-SPL mediation of flowering, tillering and fruit development
2 MiR156-SPL调节植物分蘖
植物理想株型与作物的质量和产量等密切相关[8, 42-43]，培育理想株型结构的品种是目前作物育种的重点，其中分蘖或分枝是决定植物株型结构的重要因素。研究表明，miR156-SPL在分蘖或分枝调控中具有重要作用[43-44]。水稻中过表达SPL14或将其与miR156的识别位点进行单碱基突变时，水稻分
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蘖数降低，分枝数增加；对SPL14进行RNAi干扰时，分蘖数增多而分枝数减少[8, 42]。而在番茄中，RNAi干扰SPL13表达植株的表型与过表达miR156的表型相似，表现为侧枝数和营养枝数增加2～3倍[9]，推测miR156-SPL模块对植物株型的调控作用相对保守，即miR156通过抑制SPL表达促进植物分蘖。
对miR156-SPL进行通路分析表明，下游基因TB1/FC1/BRC1可以调控植物分蘖，其中TB1 (Teosinte Branched 1)可以与分蘖促进基因MADS57形成异源二聚体，降低MADS57对D14(DWARF 14)的转录
抑制作用，从而减少分蘖数[45]。水稻植物理想株型基因IPA1 (Ideal Plant Architecture 1)编码的OsSPL14可以直接与水稻OsTB1的启动子结合，提高TB1/FC1的表达[44]。OsmiR156通过对OsSPL14转录本进行切割(cleavage)来调控其表达，当OsmiR156识别位点发生突变时，OsmiR156对IPA1抑制作用减弱，从而减少分蘖[42]。此外，miR156-SPL可能与独脚金(Striga asiatica)内脂信号转导网络(SL)存在联系，IPA1可能是miR156和独脚金内脂信号转导网络的共同靶点[34, 44]。在SL信号通路中，D53 (DWARF 53)会抑制IPA1的转录激活，而IPA1可以结合到D53的启动子上激活其表达，形成一种反馈机制(feedback loop)[34]。Liu等[35]认为小麦(Triticum aestivum)中SPL3和SPL17的表达受到miR156和D53的抑制，从而降低下游TB1的表达，促使小麦分蘖数增多。同时，miR156可能还参与光信号(PIF)介导的植物分蘖(分枝)调控网络[46]。Xu等[47]在研究miRNA 介导的DNA甲基化(RdDM)调控水稻分蘖分子机制中发现，OsMIR156d/j的转录受到RdDM抑制，从而影响成熟miR156及其靶基因IPA1在茎基部的积累，调控水稻分蘖。综上，miR156-SPL模块不仅参与独脚金内脂信号途径，还可响应外界光信号和内在DNA甲基化，在植物分蘖调控中发挥重要作用，但其潜在的分子机理仍需深入研究(图1)。
3 MiR156-SPL调节植物籽粒(果实)发育
果实或籽粒的形态是决定作物产量的重要因素。Shikata等[7]发现，AtSPL10可以影响花柄和果荚长度。通过对籼稻高产品种‘HJX74’(籽粒短而宽)和中产品种‘Basmati385’(籽粒长)的籽粒差异进行QTL定
位，鉴定到一个对水稻籽粒大小、形状和质量具有潜在调控功能的基因OsSPL16/GW8。后续研究表明，高表达水平的OsSPL16/GW8可促进细胞分裂和灌浆，影响水稻籽粒宽度和产量；而OsSPL16/ GW8功能缺失会使籽粒细长，提高其外观质量。利用QTL和分子标记辅助选择育种技术培育出携带OsSPL16和qGS3等位基因的‘华标1号’品种，在保证优质的基础上能使单株籽粒产量提高约14%[48-49]。Wang等[50]发现，水稻去泛素化酶基因OsOTUB1可促进OsSPL14的蛋白酶体降解，当OsOTUB1表达降低或功能缺失时，OsSPL14积累增加，使水稻单株分蘖数减少，粒数和粒重增加，从而实现高产的目的。Si等[51]利用GWAS对381个粳稻品种的籽粒长和宽进行分析发现，由GLW7编码的OsSPL13可以通过调节细胞大小正向调控粳稻籽粒形态，促使籽粒变长、粒数增加。
此外，过表达miR156的番茄植株果实和叶片变小、叶数增多，植株高度降低[18]。对其靶基因SISPL13进行RNAi干扰和敲除发现，转基因植株表型与过表达miR156株系相似，表现为小花数和果实数降低，平均单个果实重量减少45%～70%，导致减产约40%[9]。Colourless non-ripening (cnr)是番茄中一种典型的果实成熟突变体，cnr突变体植株可正常生长发育，但果实不能成熟，果皮呈黄，果肉呈无或白[52]。Manning等[53]通过图位克隆证实cnr突变体中的LeSPL-CNR属于SPL家族，其启动子上游存在一段超甲基化区域，此区域自发甲基化会抑制LeSPL-CNR的表达从而导致cnr突变体果实不成熟；利用病毒诱导基因沉默技术(virus induced gene silencing, VIGS)将野生型植株LeSPL-CNR沉默发现其植株表型与cnr突变体相似。Lai等[36]进一步发现，SISPL-CNR由一个核定位信号和
两个锌指结构组成，在细胞质内SlSPL-CNR被SISnRK1磷酸化，然后由核定位信号引导进入细胞核。进入细胞核的SlSPL-CNR可依赖锌指结构结合到果实成熟相关基因的启动子上，参与番茄果实成熟过程。LeSPL-CNR的3' UTR区域含有SlymiR156/157结合位点，SlymiR157通过对LeSPL-CNR mRNA进行切割或抑制其翻译来负调控果实成熟相关基因(LeMADS-RIN, LeHB1, SlAP2a和SlTAGL1)的表达，进而促进果实成熟。同时，SlymiR156-LeSPL-CNR
第 5 期韩佳婷 等：植物miR156及靶基因SPL家族的研究进展893
还参与果实软化过程[37]。在番茄中过表达miR156时，其植株果实异常，表现为果实长出额外心皮和异常结构。Silva等[54]认为这一结果是由miR156过表达导致TOMATO KNOTTED2 (LeT6/TKN2)和GOBLET (GOB)表达上调引起，暗示miR156-SPL可通过参与维持子房组织的分生状态，从而控制果实发育。推测miR156-SPL模块参与籽粒(果实)形态建成和产量调控(图1)，进一步挖掘miR156-SPL在果实发育调控中的机理将有助于分子育种。
4 MiR156-SPL调节植物胁迫响应
4.1 环境温度胁迫
温度不仅限制了植物的地理分布，也影响着植物的正常生长发育。高温是植物普遍面临的胁迫之一，
植物不同时期响应热胁迫的能力不同，通常营养期的耐高温能力较强，而生殖期尤其是开花期则较差[55-56]。MiR156-SPL可以调控植物对环境温度的响应。46 ℃高温处理芜菁(Brassica rapa) 1 h，miR156 h 和miR156 g可以被诱导表达，但是SPL2受miR156的抑制其表达量降低[57]。与此类似，40 ℃高温也可以诱导小麦miR156的表达上调[58]。Stief等[59]认为miR156可通过调控SPL响应持续的高温胁迫，其原理可能是高温诱导植物体内miR156表达升高，抑制下游靶基因SPL的表达，从而延长营养期，避免植物在高温条件下开花，达到响应热胁迫的效果。Ding等[60]认为miR156-SPL可以通过抑制下游相关热响应基因来适应环境温度变化，也可以直接抑制热激转录因子HsFA2的转录参与到热胁迫分子的调控网络中。MiR156-SPL还在植物响应低温胁迫中发挥作用。4 ℃条件下野生型和过表达miR156k 水稻植株对低温的敏感性存在显著差异，可能与miR156k的表达上调有关[61]；Zhang等[62]发现茶树(Camellia sinensis)中miR156的两个靶基因CsSBP8和CsSBP12对低温敏感，推测其参与低温胁迫响应过程。
4.2 其他非生物胁迫响应
除温度胁迫外，miR156-SPL还参与其他非生物胁迫的调控过程。对盐生植物柽柳(Tamarix chinensis)的研究表明，盐胁迫后1 h可能是miR156-SPL转录后调控的关键时间点[15]；过表达NtabSPL6烟草其发芽率提高，电解质渗透率和过氧化氢(H2O2)含量降低，抗盐能力增强[63]；过表达miR156白桦(Betula platyphylla)植株在盐胁迫12 d后，其盐害指数显著高于对照。复水后转基因植株的超氧化物歧
化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降，而H2O2和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量上升，表明提高miR156的表达水平能降低植物对盐胁迫的耐受性[64]；Ding等[65]发现，miR156-SPL可以通过调节玉米(Zea mays)的生理代谢及侧根形态特征来响应盐胁迫。短期干旱胁迫后复水处理，过表达VpSPL16拟南芥植株复活，而对照全部死亡。对过表达植株的生理指标和下游已知胁迫基因进行表达量检测，发现其活性氧积累较少而AtCOR15a表达量上调，表明VpSPL16可能通过参与活性氧的清除过程以及与下游胁迫基因相互作用，从而提高拟南芥植株的耐盐性和耐旱性[66]。MiR156-SPL虽响应多种非生物胁迫，但其分子调控网络研究尚不深入，如目前对miR156-SPL如何感知外界胁迫信号并通过调控下游相关基因来响应逆境的机理研究较少。
4.3 生物胁迫
植物在生长和发育过程中，容易受到诸如细菌、病毒、真菌、昆虫等病虫害的影响，而miR156-SPL模块参与植物响应生物胁迫的过程[67]。TIR-NB-LRR是植物中的一类抗病基因，烟草抗花叶病毒的N基因就属于此类抗病基因。研究发现，NbSPL6在抗烟草花叶病毒中发挥着重要的作用[63, 68]。灰霉菌是农业生产中引起植物病害的主要病原菌之一，当经济作物感染后，会因采后腐烂而造成损失[69]。张丽[63]发现，过表达NtabSPL6-2拟南芥植株对灰霉菌有明显抗性，转基因NtabSPL6植株叶片萎蔫程度较轻且坏死区域的面积较小，其抗性相关基因PR1和PR5的表达水平均比野生型的侵染叶片高。病原菌胁迫下，过表达miR156植株比对照植株具有更强的SOD、过氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧
化酶(polyphenol oxidase，PPO)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活性，相关抗病基因MYB106、MYB61、RPP13、RPM1的表达显著上调，推测miR156可能通过增强相关抗病基因的表达来提高白桦的抗病能力[64]。茉莉酸甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase，JMT)是抗病信号物质茉莉酸甲酯(methyl Jasmonate，MeJA)合成过程中的关键酶[70]，
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