瘤胃发育过程中微生物菌和microRNA的调控作用 王磊
【摘 要】传统的藏羔羊生产方式因营养因素造成羔羊胃肠道发育迟缓、断奶过渡期长,影响了羔羊生产潜力发挥及断奶后的育肥.成年动物瘤胃已建立了十分成熟稳定的微生物生态系统,其瘤胃宿主与微生物菌之间存在很强的特异性,外源性干预一旦停止,瘤胃微生物菌结构和发酵谱又恢复到初始状态或干预前的状态.然而,新生或出生早期反刍动物瘤胃的发育为改变或干预瘤胃微生物生态系统提供了唯一的机会.因此,羔羊瘤胃的发育规律及瘤胃与瘤胃微生物和相关基因之间的关系成为当前反刍动物研究的热点. 【期刊名称】《家畜生态学报》
【年(卷),期】2019(040)003
【总页数】5页(P1-5)
【关键词】瘤胃发育;微生物菌;microRNA;调控
【作 者】王磊
【作者单位】青海大学畜牧兽医科学院,西宁810016;青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,西宁810016
【正文语种】中 文
【中图分类】S811.5
藏羊养殖是青海高原特、现代、生态畜牧业的支柱产业之一，对青海地区农业和畜牧业的发展起到至关重要的作用。目前，藏羊存栏量达1 100多万只，年出栏589万只，年产藏羊肉7.5×104 t、藏羊毛1.72×104 t。但由于青藏高原缺氧、寒冷、干燥的气候环境，牧草生长期短暂而枯草期漫长，导致牧草产量和营养供给能力下降，再加上牧民养殖知识贫乏和饲养管理粗放，藏羊的生长、生产和繁殖性能受到严重制约[1]。传统天然放牧条件下，由于过长的哺乳期(150 d)，母乳已无法满足羔羊的生长发育需要，造成羔羊胃肠道发育迟缓，进而影响羔羊后期的生长发育和母羊的繁殖性能[2]。早期断奶技术虽在牧区已开展应用，但其对羔羊瘤胃发育(尤其是瘤胃上皮细胞的分化)的影响机理尚不清楚，同时对羔羊后
期的生长发育、生产繁殖性能也缺乏长期的追踪性调查。因此，通过运用分子手段和基因组测序技术，了解清楚羔羊瘤胃的发育规律及瘤胃与瘤胃微生物和相关基因之间的互作关系，才能为羔羊的断奶和培育提供理论基础。
1 瘤胃发育及其重要性
瘤胃发育对幼龄反刍动物的消化能力和底物供应具有显著的影响。幼龄反刍动物瘤胃的功能和生理结构与成年动物有着很大的区别，其瘤胃的发育是一个重要的生理挑战，伴随瘤胃的生长和细胞分化，并导致营养吸收模式发生转变[3]。瘤胃发育过程包括解剖结构的发育(瘤胃乳头的生长和质量的增加)[4]，功能的获取和完善(发酵能力和酶活性)[5]，以及微生物的定植(细菌，真菌，产甲烷古菌和原虫)[6]，据此分为3个阶段：非反刍阶段(0～3周龄)、过渡阶段(3～8周龄)、反刍阶段(8周龄以后)[7]。瘤胃发育不完善会严重影响营养物质的消化和吸收，甚至导致如呼吸道疾病和腹泻病[3]。相反，完善的瘤胃发育有利于饲料成分的消化，为动物的生理要求提供营养物质，从而促进机体的生长发育，提高机体的抗病能力，保证机体的健康。
2 瘤胃微生物及与瘤胃宿主的关系
瘤胃微生物由参与复合碳水化合物发酵的细菌、古细菌、原生动物和真菌组成，其组成受许多因素的影响，如反刍动物种类、年龄、日粮、季节和地理区域以及附着部位等[8]。在反刍动物出生当天，可检测到细菌和古细菌，真菌和原虫的数量几乎为零；出生后的2 d，厌氧细菌在新生反刍动物瘤胃中占据主导地位，并且在出生的第1周内纤维分解细菌的密度稳定；出生后的7 d，新生瘤胃中出现厌氧真菌和产甲烷菌和原虫；28 d后，细菌、古细菌、真菌和原虫的数量基本保持恒定状态[9]。瘤胃3个连续的生态相中聚居了各自特异性的微生物菌，并集中了微生物代谢活动所产生的相关底物及终产物(如各种消化酶和挥发性脂肪酸等)。相关底物及终产物的刺激促进了瘤胃乳头的发育和上皮细胞的增殖分化，并造成瘤胃生理结构的显著差异[10]。寄居在反刍动物瘤胃内的微生物是一个复杂的落，其与胃肠道宿主共同进化并最终形成稳定和谐的共生系统[11]。瘤胃为瘤胃微生物的生长繁殖提供持续而稳定的生活环境，瘤胃微生物通过自身分泌的各种酶类、短链脂肪酸和菌体蛋白，并通过一系列生物化学反应，将饲草料转化为反刍动物能够消化和吸收的营养物质。瘤胃微生物(细菌、真菌、原虫)的种类、数量和丰度与各种营养素(维生素、矿物质)的消化、吸收和(糖类、脂类、固醇类和能量)代谢具有极显著的相关性，同时微生物菌宏基因组中含有的基因数量是宿主基因数量的150倍[12]。因此，瘤胃微生物互作对维持反刍动物
mirna靶基因分析生理、营养和免疫功能的稳定具有重要作用，瘤胃微生物区系的动态平衡是瘤胃发育的前提。
随着分子生态学、分子营养学和宏基因组测序技术的发展，克服了微生物分离纯化培养的瓶颈，对深入了解未知菌(如产甲烷菌)代谢机制和生物学功能，为提高反刍动物消化吸收能力和降低环境污染奠定了基础[13]；同时，瘤胃微生物宏基因组基因丰度将有可能成为一种新的遗传标记或分子育种手段，被用于选育具有低甲烷排放和高饲料转化率的反刍动物[14]。周亚文等从瘤胃微生物互作的角度阐述了可以调控瘤胃甲烷产量的2种途径：①通过控制产氢菌数量，如去原虫或建立以不产生氢的纤维素分解菌为优势菌的瘤胃生态系统；②通过改变电子受体，使电子流向除产甲烷菌以外的其他微生物[15]。国内施鹏课题组和赵方庆课题组及龙瑞军课题组合作，采用宏基因组学研究方法，从能量代谢角度揭示了高原哺乳动物宿主基因组与肠道微生物宏基因组的适应性和趋同性进化，肠道微生物组在短链脂肪酸代谢通路上基因的显著富集，以及高原哺乳动物自身强大的短链脂肪酸吸收和运输能力，能够产生更多的短链脂肪酸和更少的甲烷[16]。由此说明，通过改造和调控瘤胃微生态系统的组成可作为减少甲烷排放的一种新途径，但不能忽视宿主与瘤胃微生态之间的相互作用，以及瘤胃微生态整体性和系统性[15]。
越来越多的证据表明，微生物菌功能性紊乱或与宿主共生关系的破坏，可能导致机体免疫力降低[14,31-32]，增加患炎症性胃肠道疾病(如瘤胃酸中毒或亚急性酸中毒)的风险和产生肥胖[17-18]。当胃肠道不断遭受外来抗原(即食品原料，共生微生物，致病的细菌、病毒和寄生虫)刺激时，肠上皮细胞和粘膜细胞产生免疫互作，大量信号从上皮细胞向各种先天性和获得性的免疫反应粘膜细胞传递，形成粘膜免疫稳态和高度复杂的免疫调节系统，同时肠上皮细胞(包括柱状上皮细胞、潘氏细胞、内分泌细胞和杯状细胞)在宿主与外部环境之间形成第一个物理性屏障[19]。因此，对瘤胃微生物的功能及其活动规律的研究是非常复杂且相当困难的。
反刍动物瘤胃包含各种各样的原核(细菌、古细菌和病毒)和真核(原虫和真菌)微生物，其共同参与对饲料原料的降解和发酵，促进动物机体对营养成分的消化和吸收，进而影响动物的饲料转化效率和生产性能[20]。长期以来，研究人员致力于开发酶制剂、生物菌剂或各种营养性添加剂，通过靶向作用于关键微生物菌的重要代谢途径来改变瘤胃的发酵，但仅能取得短期效果，甚至出现相反的效果[21]。由于成年动物瘤胃已建立了十分成熟稳定的微生物生态系统，瘤胃宿主与微生物菌之间存在很强的特异性，因此外源性干预(如瘤胃食糜交换、外源菌剂的添加或抗生素)一旦停止，瘤胃微生物菌结构和发酵谱又恢复到
初始状态或干预前的状态[22]。然而，新生或出生早期反刍动物瘤胃的发育为改变或干预瘤胃微生物生态系统提供了唯一的机会[21]。研究表明，对新生的山羊羔羊持续进行3个月的日粮干预，将改变断奶后羔羊瘤胃微生物的组成，并影响宿主的表型(甲烷排放、挥发性脂肪酸组成)[23]；Morgavi等[24]通过限制出生早期羔羊瘤胃原虫的数量或捕获能力，可以改变羔羊生长发育后期瘤胃微生物的组成和发酵能力，以及尿素代谢；Barbieri等[25]研究表明，调整母羊的日粮结构，通过哺乳或接种母羊瘤胃液，可改变羔羊瘤胃细菌落或微生物区系，且这一改变能够在羔羊断奶后持续发挥作用。综上所述，与成年反刍动物相比，对新生或出生早期反刍动物瘤胃微生物的干预能够取得更好和更长期的效果。
3 microRNA及与微生物菌互作在胃肠道发育过程中的调控作用
遗传学中心法则中RNA是DNA和蛋白质之间的工作信使，但在整个真核基因组的转录过程中，产生了大量的非蛋白质编码RNA，它们表现出复杂的重叠表达和调控模式。miRNA是编码在基因组中的一种小RNA分子，它在控制基因表达方面有着深远的影响。miRNA与靶mRNA结合并下调其稳定性或翻译。每个miRNA预测有许多靶基因，每个mRNA可以由多个miRNA调节。miRNA在控制DNA甲基化和组蛋白修饰中起重要作用，产生高度可控的反
馈机制。在胃肠道发育过程中，miRNA参与调节上皮细胞分化、成熟、炎性肠病、病原体感染、黏膜免疫、营养代谢、肠道流动性和电解质运输及通透性等生物过程[26-28]。除此之外，近来许多研究表明，miRNAs可能参与宿主与微生物的互作[29]。
在原虫感染的小鼠肠道中，miR-27b的表达上调，其可以抑制TLR4/NF-kB信号通路中KH型剪接调节蛋白的表达(抗菌活性因子)[30]。在无菌鼠肠道微生物的定植过程中，miR-665能够调节耐药相关的Abcc3 mRNA表达，Abcc3能够调节肠道中异生物质和内源性毒素的代谢[29]。Xue等[30]通过建立基因缺失小鼠和无菌小鼠模型，研究了共生菌对肠道miRNA表达的影响，不同的TLR配体能够通过MyD88依赖型信号途径下调DCmiR-10a的表达，进而靶向调节IL-12/IL-23p40的表达，维持肠道免疫稳定。Singh等[32]强调了内源性微生物与盲肠miRNA的相互作用，发现34个预测miRNA靶基因编码的蛋白参与肠道屏障功能和免疫调节。Giahi等[33]发现，鼠李糖乳杆菌能够显著下调miR146-a表达，上调树突状细胞miR-155表达，并伴随p38 MAPK的下调，减弱炎症反应。适宜生理浓度的原儿茶酸能够通过抑制巨噬细胞中miRNA-10b的表达，促进小鼠巨噬细胞中胆固醇排出，抑制血管壁炎症反应，抵抗动脉粥样硬化[34]。Biton等[35]通过建立肠道Dicer1缺失小鼠模型发现，Dicer1缺失可通过调节与杯状细胞分化相关的miRNA-357的表达，抑制KLF5的转录，导致肠道杯
状细胞衰竭，同时降低IL-4，IL-5和IL-13的表达，增强鼠鞭虫易感性。
近年来，研究人员开始关注miRNA在反刍动物瘤胃、肠道发育中的作用，以及对反刍动物奶蛋白和奶品质的影响。Liang等[36]研究结果表明，miR-143及其靶基因参与出生早期奶牛胃肠道结缔组织和肌肉细胞的增殖；miR-15/16、miR-29和miR-196表达水平与双歧杆菌和乳酸杆菌16S rRNA基因拷贝数呈显著正相关。Wang等[37]的研究结果表明，一些miRNAs(瘤胃miR-99b、miR-21-3p，十二指肠miR-2336，空肠miR-652，肝脏miR-1，乳腺miR-181a、miR-2285f)与奶牛饲料转化效率和氮代谢存在非常高的关联性，其靶基因参与氨基酸的运输和磷酸化作用，进而影响奶牛的产奶量和奶蛋白，其中miR-21-3p可通过ATP1A2靶向调节氨基酸的运输；同时奶牛特异性miRNAs能够调节瘤胃上皮细胞的增殖和形态，以及肝脏脂质代谢和支链氨基酸代谢。 因此，miRNA可以通过靶向调节胃肠道上皮细胞的增殖分化，调节免疫应答信号途径中的关键分子，调控胃肠道免疫功能和应答水平；其次，肠道微生物的代谢产物和相关底物可调控宿主细胞miRNA的表达，影响胃肠道上皮细胞的生理、营养和免疫功能。
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