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宋 琪 潍坊医学院 山东潍坊 261053
摘要：目的 使用生物信息学分析，构建竞争内源性RNA网（ceRNA）和临床预后模型，探讨肾透明细胞癌潜在的生物标志物及其预后价值。方法 从TCGA数据库下载肾透明细胞癌和癌旁组织的转录组和临床数据，利用R软件筛选出差异表达的lncRNA、mRNA、miRNA，然后利用miRcode、TargetScan、miRTarBase 和miRDB 等公共数据库建立lncRNA-miRNA及miRNA-mRNA的关系对，对网络中的三种RNA进行总体生存分析并进行COX回归分析构建预后模型。结果 差异分析显示肾透明细胞癌与癌旁组织相比，存在显著差异的lncRNAs1517个、mRNAs2331个、miRNAs173个(|logFoldChange| < 2,P<0.05)，基于此构建了包含125个DElncRNA、52个DEmRNA以及25个DEmiRNA的ceRNA 网络，检测到其中29个lncRNAs、18个mRNAs、7个miRNAs与总生存期显著相关（P <0.01）。分别构建网络中三种RNA的预后模型，显示出包含3个lncRNAs、9个mRNAs、6个miRNAs的模型具有较高可信度。lncRNA(WTI- AS/AC016773.1/LINC00460),mRNA(has-mir-144/ has-mir-223/ has-mir-21),miRNA(NOD2/IL11/COL4A4/RRM2)在生存分析及预后模型中均显示出其重要意义。结论 本研究通 过构建肾透明细胞癌相关的ceRNA网络及其预后模型，探讨了新的肾透明细胞癌预后相关的可能潜在生物标记物，可能作为肾透明细胞癌的靶点。
肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常见的泌尿系肿瘤，肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）约其占70-80%[1]。ccRCC发病机制目前尚不清楚，可能与吸烟、遗传等因素相关。其对放、化疗不敏感，局部手术是早期肾癌的主要方法。晚期肾癌的靶向药物选择因为缺乏明确的靶点而非常局限。[2]因此鉴别肾透明细胞的预后标志物，为寻其靶点提供理论依据尤为重要。
1材料与方法
1.1 数据下载与预处理 从TCGA数据库筛选并下载肾透明细胞癌患者的转录组分析数据和临床信息（截止时间为2019年9月）。利用R软件的TCGABiolinks包对三种RNA表达谱进行整合和提取。使Ensembl在线数据库对基因进行注释并换为基因名称。
1.2 筛选差异表达的lncRNA、mRNA、miRNA用edgeR软件包对下载的三种RNA进行差异表达分析（log2FoldChange（FC）|> 2，P<0.05）。使用R软件的ggplots2包绘制了三种RNA的火山图。
1.3 构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络 利用miRcode在线工具预测DElncRNAs靶向miRNA，建立lncRNA-miRNA相互作用对。STARBASE v
2.0数据库对DEmiRNAs序列进行解码。用miRDB、miRTarBase、TargetScan3个数据库预测DEmiRNAs的靶基因，建立miRNA-mRNA相互作用对，并利用Venny在线网站将预测的DEmiRNA的靶基因与本研究中DEmRNA取交集。基于lncRNA-miRNA和miRNA-mRNA关系对，建立lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络。
1.4 生存分析 R软件的survival包对ceRNA网络中差异表达3种RNA进行了Kaplan-Meier（K-M）独立生存分析（P＜0.01）。
1.5 构建预后模型及独立预后分析 利用R软件的survival包、glmnet包、survminer包分别对三种RNA进行单因素Cox比例风险回归分析（P＜0.05）、LASSO回归、多因素Cox回归分析。R软件中survival 包用于绘制K-M 生存曲线。使用R软件中的ROC软件包估计三种RNA 模型在ROC曲线下的面积（AUC）。
2结果
2.1 TCGA数据集的预处理及差异分析 从611例标本中收集了lncRNAs 和mRNAs的表达数据（539例肿瘤标本、72例正常标本）；miRNA表达样本616个（肿瘤样本545个，正常样本71个）。差异分析显示1517个差异表达的lncRNA(1068个上调，449个下调)；2331个mRNA差异表达（1569个上调、762个下调）；173个差异表达的miRNAs（106个上调，67个下调）。
2.2 构建ceRNA网络 使用在线网站miRcode和STARBASE v2.0数据库筛选出lncRNA-miRNA对，包含125个DElncRNA和25个DEmiRNA。运用miRDB，miTarBase 和TargetScan在线数据库发现1040个靶基因，获得与本研究相关的差异表达的DEmRNA52个。并基于DElncRNAs-DEmiRNAs 靶标对和DEmiRNAs-DEmRNAs 靶标
对构建ceRNA网络。
2.3 CeRNA网络中差异基因的生存分析 基于R软件survival包（P <0.01），125个lncRNAs中共鉴定出29个与肾透明细胞癌的预后密切相关，其中高表达的CHL1-AS1、COL18A1-AS1、LINC00443、LINC00472、SLC25A5-AS1、TCL6与高生存率相关，可作为抑癌因子；但是高表达的AC004832.1、AC011510.1、AC01677
3.1、AC105020.1、AL356356.1、AP001029.2、C20orf203、FAM13A-AS1、HOTTIP、IL20RB-AS1、LATS2-AS1、LINC00299、LINC00460、LINC00524、MIAT、MLIP-AS1、MTUS2-AS1、NALCN-AS1、PVT1、TRIM36-IT1、UCA1、VCAN-AS1、WT1-AS与较低的生存率相关，提示这些lncRNAs可能为致癌因子。52个mRNAs中共发现18个mRNA与预后相关，其中高表达的CCND1、COL4A4、ERMP1、ESRRG、PRELID2、SLC22A6预后较好，而高表达的E2F1、E2F2、GOLGA8A、GOLGA8B、IL11、NOD2、POLQ、RRM2、SLC12A5、SPI1、TFAP2C、TGFBI预后
不良。25个miRNAs中分析得到7个miRNAs与预后相关，其中高表达的hsa-mir-144、hsa-mir-204、hsa-mir-215与高生存率相关，高表达的hsa-mir-21、hsa-mir-155、hsa-mir-221、hsa-mir-223与不良预后相关。
2.4 构建预后模型及独立预后分析 对ceRNA网络中的3种RNA 单变量Cox比例风险回归分析，得到42个lncRNAs、26个mRNAs和9个miRNA（P<0.05）；将结果进行LASSO回归分析，并进行2000倍随机交叉验证，分别得到3个lncRNAs、13个mRNAs和9个miRNA；将LASSO回归分析结果进一步提交多因素Cox比例风险回归分析，得到3个lncRNAs（WT1-AS、AC01677
3.1、LINC00460），6个miRNA （hsa-mir-184、hsa-mir-301b、hsa-mir-144、hsa-mir-223、hsa-mir-200a、hsa-mir-21）和9个mRNA （PCDHA12、NOD2、BTG2、PRELID2、IL11、COL4A4、GOLGA8B、GOLGA8B、RRM2、COL5A3）。根据这3个风险预后模型，计算患者风险评分，根据中位风险评分，将患者分为高低风险组。K-M分析显示，在三种模型中，高风险组和低风险组的OS存在显着差异（图1 A-C）。计算lncRNA、mRNA 和miRNA的5年曲线下的面积（AUC）值，分别为0.696、0.733、0.742，说明模型具有较高可信度。
3讨论
竞争内源性RNA (Competing endogenous RNAs， ceRNAs)是一种通过竞争共享的miRNAs在转录后
水平上相互调控的转录产物。研究表明，ceRNAs是转录后调控的关键，广泛的参与多种癌症的发生、发展[3、4]。但在肾透明细胞癌相关的研究中涉及ceRNA的较少。本研究中我们基于TCGA数据库，应用R软件等相关技术构建了肾透明细胞癌的ceRNA调控网络并构建了预后模型。最终筛选出3个lncRNAs、6个miRNA和9个mRNA。在3个lncRNA中，曾有研究表明，WT1-AS在NSCLC中过表达通过下调UCA1抑制NSCLC细
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胞的侵袭和迁移[5]； WT1-AS在肾透明细胞癌可以作为独立的预后因子[6]
，这与我们的研究结果相一致。在肾癌的研究中，有研究表明LINC00460参与了ceRNA的构建，这也印证了我们的研究。较少有研究表明AC016773.1与癌症的关系。miRNA中，hsa-mir-21的过表达被认为是肾细胞癌患者临床病理特征和不良预后的重要预测因子，在肾癌中起重要作用[7]；有研究表明hsa-mir-144与ccRCC 患者的OS呈正相关[8]
。hsa-mir-184是一种具有抗凋亡作用的致癌miRNA，其在乳腺癌中的表达也上调[8]
；hsa-mir-301b、hsa-mir-200a与肾母细胞瘤、乳腺癌[9]等相关，目前未查阅到与肾透明细胞癌相关
的研究；hsa-miR-223可能协同下调多种肿瘤抑制基因的表达，从而降低肾透明细胞癌患者的生存[10]。9个DEmRNA中，NOD2在多项研究中被证实与恶性肿瘤相关，如结直肠癌、肺癌[11]。一项对照实验研究表明BTG2过表达抑制人肾癌细胞的生长、迁移和侵袭[12]
。曾有研究表明COL5A3在肾透明细胞癌中起关键作用[13]mirna靶基因分析
，这也证实了我们的研究结果。有研究指出，RRM2与肝癌、肺腺癌的发生、发展有关，并通过激活EGFR/AKT促进细胞化疗耐药[14]
。IL-11高表达是ccRCC患者预后不良的独立预测因子[15]
。几乎没有研究提供直接的证据表明GOLGA8B、CDHA12和COL4A4与癌症有关，有待进一步的研究。
综上所述，通过构建肾透明细胞癌ceRNA网络和预后模型，lncRNA（WT1-AS、LINC00460、AC016773.1），miRNA（hsa-mir-21、hsa-mir-144、hsa-mir-223），mRNA（NOD2、PRELID2、IL11、COL4A4、GOLGA8B、RRM2）在生存分析和预后模型中均显示出对于肾透明细胞癌的重要意义，为指导乳腺癌的和深入研究提供了新的诊断和预后生物标志物。参考文献
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