患者血清中miRNA-16和miRNA-155检测的临床意义 时广利;马尚;尹颜军;张鑫桐;白万秋;荣长利
【摘 要】目的 通过检测患者血清中miR-16和miR-155的表达量,探讨其作为辅助诊断和鉴别诊断指标的临床应用价值.方法 应用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测72例患者、50例肺癌患者和45名健康人血清中miR-16和miR-155的表达量,分析其在检测中的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值.结果 患者血清中miR-16的表达量显著高于健康人组和肺癌组,差异具有统计学意义(F=5.564,P<0.01);而患者血清中miR-155的表达量显著低于健康人组和肺癌组,差异具有统计学意义(F=2.563,P<0.05);血清miR-16和miR-155在中检测的灵敏度分别为44.4％和41.7％、特异度分别为88.4％和84.2％、阳性预测值分别为74.4％和66.7％、阴性预测值分别为67.7％和65.6％.二者联合对检测的灵敏度明显提高,达到了56.9％,与单项miR-16、miR-155比较,差异具有统计学意义(χ2=4.003,P<0.05).结论 患者血清中miR-16和miR-155的检测对于的辅助诊断及鉴别诊断具有一定的临床参考价值. 【期刊名称】《临床肺科杂志》
【年(卷),期】2019(024)008
【总页数】5页(P1450-1454)
【关键词】;微小RNA;辅助诊断;实时荧光定量PCR
【作 者】时广利;马尚;尹颜军;张鑫桐;白万秋;荣长利
【作者单位】101149 北京,北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院;101149 北京,北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院;101149 北京,北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院;101149 北京,北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院;101149 北京,北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院;101149 北京,北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院 【正文语种】中 文
结核病是机体感染结核分枝杆菌而引起的慢性传染病，其病死率在单一病因传染病中位居
首位。目前，结核病仍是一个威胁人类健康的全球性公共卫生问题，由于用药的不合理、不规律以及缺乏管理等原因，结核病仍在全球流行。中国结核病发病率为78/10万，位居全球第三位[1]。微小RNA(miRNA)广泛存在于真核细胞中，是高度保守的非编码单链RNA分子，miRNA与多种疾病(肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等)的发生、发展有着密切的关联[2]。miRNA能够非常稳定地存在于人的血清中，反复冻融也不受影响，有可能作为疾病诊断的辅助血清学指标[3]。近年来有研究表明，miR-16和miR-155能够参与宿主的免疫应答反应，miR-16在尘肺合并患者血清中过量表达，miR-155有可能是诊断的生物标志物[4-5]。因此，本研究对患者、肺癌患者与健康人对照血清中miR-16和miR-155的表达量进行了测定，探讨血清miR-16和miR-155作为辅助诊断和鉴别诊断指标的临床参考价值。
资料与方法
一、 一般资料
2016年10月至2017年12月北京市结核病胸部肿瘤研究所收治确诊的患者72例，男性41例、女性31例，年龄18～63岁(平均40.2±12.6)；其中菌阳40例、菌阴3
2例；初治47例、复治25例。所有患者综合影像学、痰细菌学、临床表现或诊断性抗结核药物有效等临床资料进行确诊[6]。肺癌患者50例，为北京市结核病胸部肿瘤研究所收治确诊的患者(全部经病理学确诊)，男性29名、女性21名，年龄41～69岁(平均55.8±24.9)。健康人为北京市结核病胸部肿瘤研究所体检健康职工45名，男性21名、女性24名，年龄24～56岁(平均43.2±13.8)，血脂、肝肾功能指标正常，无高血压、糖尿病、肺部感染、自身免疫性疾病史等。病例组、对照组和健康人组的年龄及性别无显著性差异。
二、 标本采集
收集患者、肺癌患者和健康人对照外周静脉血3mL(非抗凝)。所有样本在1小时内进行离心(4000转/分)，然后将分离出的血清分装于消毒灭菌后的EP管中，所有血清样本放于-80℃超低温冰箱中冷冻保存，用于miRNA的提取及检测。此研究通过了北京市结核病胸部肿瘤研究所伦理委员会的审核(批件号2016-01-01)。
三、研究方法
1 总RNA的提取
采用北京天根生化公司生产的RNA提取试剂盒 (批号：Tiangen DP501)完成所有标本的miRNA提取，包括标本的解冻、裂解，氯仿、无水乙醇的抽提，吸附、溶解、RNA浓度测定等步骤。
mirna靶基因分析2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
室温融化2×miRcutemiRNA premix(含SYBR)和逆转录引物(10μM),使用时将2×miRcutemiRNA premix 上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。然后将试剂置于冰上,反应体系如下：
2×miRcutemiRNApremix10.0μlForwardprimer(10μM)0.4μlReverseprimer(10μM)0.4μlcDNA模板1.0μlDEPC-ddH2O8.2μl(20μl体系)94℃2分钟;(预变性)94℃20秒;60℃34秒;45个循环。
配置完成后立即放置于Roche lightcycler实时荧光定量PCR扩增仪中进行扩增。在每个qRT-PCR反应中都设置有阴性对照，以U6作为内参照。上游引物序列(5′-3′)内参：AGCAGCATTGTACAGGGCTATGA、miR-16：TAGCAGCACGTAAATATTGGCG、miR-1
55：TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT，下游通用引物：5′-TCAA CGAT ACGC TACG TAACG AAAAA AAAAA-3′。qRT-PCR实验数据分析应用lightcycler软件，自动设置PCR反应的基线值及界值，每个样本重复3次表达量的检测。miR-16和miR-155的检测结果以2-ΔCt的形式表示，Ct值反应检测的灵敏性，同一份标本在不同条件下检测，若其值越低表明灵敏性越高。
四、 统计学处理
统计学数据分析应用SPSS软件进行，所有实验数据以均数±标准差表示；全部数据先进行正态性检验，正态性分布数据采用方差分析，非正态性分布数据采用非参数检验，组间率的比较采用χ2检验。P值小于0.05时为差异具有统计学意义。灵敏度计算方法为：病例组阳性例数/病例组总例数；特异度计算方法为：对照组阴性例数/对照组总例数；阳性预测值计算方法为：病例组阳性例数/病例组阳性例数+对照组阳性例数；阴性预测值计算方法为：对照组阴性例数/对照组阴性例数+病例组阴性例数。
结 果
一、血清miR-16和miR-155的检测结果
患者血清中miR-16的表达量显著高于健康人对照组和肺癌患者组，差异具有统计学意义(F=2.087, P<0.01)；患者血清中miR-155的表达量显著低于健康人对照组和肺癌患者组，差异具有统计学意义(F=2.563, P<0.05)。血清miR-16和miR-155在健康人对照组中的表达量与肺癌患者组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。(见表1)。
二、患者血清miR-16和miR-155的检测结果
患者根据痰涂片抗酸染或结核菌痰培养的检查结果分为菌阳(痰涂片或痰培养阳性)和菌阴(痰涂片和痰培养均阴性)；患者根据是否应用过抗结核药物进行情况分为初治和复治。(见表2)所示，血清miR-16和miR-155在菌阳患者中的表达量与菌阴患者比较、初治患者与复治患者比较、以及男性患者与女性患者之间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
表1 血清中miR-16和miR-155表达量组别nmiR-16miR-155健康人组4511.64±6.631.412±0.772肺癌组5012.51±7.85c1.369±0.603d组7231.12±16.740.661±0.304F值5.5642.563P值0.008a0.012b
注：与健康人组及肺癌组之间比较，aF=5.564，P=0.008；bF=2.563，P=0.012；肺癌组与健康人组比较，cP=0.611；dP=0.702
表2 患者血清中miR-16表达量组别nmiR-16t值P值菌阳4032.85±15.030.7280.512a菌阴3230.22±14.15初治4729.26±14.390.7310.505b复治2532.98±15.35男性4131.96±14.910.6690.586女性3130.87±14.25
菌阳与菌阴比较，aP>0.05；初治与复治比较，bP>0.05；男性与女性比较，cP>0.05
表3 患者血清中miR-155表达量组别nmiR-155t值P值菌阳400.579±0.3030.5140.617a菌阴320.695±0.312初治470.701±0.3750.7220.516b复治250.515±0.299男性410.675±0.3010.4540.651c女性310.648±0.295
菌阳与菌阴比较，aP>0.05；初治与复治比较，bP>0.05；男性与女性比较，cP>0.05
三、 血清miR-16和miR-155检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值
血清miR-16和miR-155在中检测的灵敏度分别为44.4%和41.7%、特异度分别为88.4
%和84.2%、阳性预测值分别为74.4%和66.7%、阴性预测值分别为67.7%和65.6%。二者联合对检测的灵敏度明显提高，达到了56.9%，特异度略有下降(为80.0%)；miR-16与miR-155联合检测的灵敏度与单项miR-16、miR-155比较，差异具有统计学意义(χ2=4.003, P<0.05)。(见表4)。
表4 血清miR-16和miR-155在中的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值(%)组别灵敏度特异度阳性预测值阴性预测值miR-1644.488.474.467.7miR-15541.784.266.765.6miR-16+miR-15556.980.068.371.0χ2值4.003P值0.033a
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