技术分享：做lncRNAcircRNA分⼦海绵研究，您需要了解这些技术【⽔深坑⼜多】 做lncRNA/circRNA分⼦海绵研究，您需要了解这些技术。
1.Northernblot
2.RACE
3.FISH
4.RIP
5.RNApulldown
6.RAP/TRAP
不想看技术简介的，可以直接拖到⽂末，有⼲货表单哟~
1．Northernblot（RNA印记技术）
技术应⽤：
1定性及定量分析基因转录⽔平差异；
2检测⽬的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。
技术原理：
提取质量良好的RNA样品，并将其固定在硝酸纤维膜或尼龙膜等固相上，加⼊标记的
核酸探针进⾏杂交。按照碱基互补配对原则，核酸探针会与固相上的RNA同源序列进⾏互 补，加⼊显⾊系统即能显⽰出杂交信号，通过检测信号的有⽆、强弱可以对样品定性、定量
分析。
技术要点：需要质量好的，且表达量⾼的RNA样品，可以先做QPCR检测。
2．RACE（cDNA末端快速扩增技术）
技术应⽤：
1获得lncRNA全长
RACE是⼀种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效⽅法，
通过测序可获得⽬的mRNA的全长序列。mirna靶基因分析
技术要点：需要质量好的RNA，多挑克隆以获得最长最有可能的RNA⽚段。
技术要点：需要质量好的RNA，多挑克隆以获得最长最有可能的RNA⽚段。
3．FISH（荧光原位杂交）
使⽤特异性探针对RNA进⾏荧光标记，适⽤于mRNA/lncRNA/miRNA在细胞/组织中
的表达定位检测。
技术应⽤：
1⽤于组织/细胞miRNA/lncRNA/circRNA的表达定位检测；
2⽤于组织/细胞lncRNA-miRNA，circRNA-miRNA共定位检测；
3⽤于细胞倍性检测。
技术要点：探针特异性要好。
4．RIP（RNA结合蛋⽩免疫沉淀）
RIP是研究细胞内RNA与蛋⽩结合情况的技术，是了解转录后调控⽹络动态过程的有
⼒⼯具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点，miRNA/lncRNA/circRNA的结合蛋⽩如AGO2等。
技术应⽤：
1内源检测miRNA与靶基因3’UTR区的结合（miRNA-mRNA-AGO2）；
2内源检测lncRNA/circRNA-miRNA-AGO2的结合。
技术要点：准备5*10E7个以上细胞，保证细胞状态良好以最⼤化模拟正常⽣理状态下的RNA与蛋⽩间的相互作⽤。
5．RNApulldown(体外研究蛋⽩质与RNA互作)
使⽤体外转录法表及⽣物素RNA探针，然后与胞浆蛋⽩提取液孵育，形成RNA-蛋⽩
复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从⽽与孵育液中的其它成分分离。复合物洗脱后，通过WB或MS检测特定的RNA结合蛋⽩是否与RNA相互作⽤。
技术应⽤：体外研究蛋⽩与RNA相互作⽤关系。
技术要点：在实验之初，需先获得⽬的miRNA/lncRNA/circRNA（调取/合成），设计探针并进⾏⽣物素标记。
6．RAP/TRAP(RNAantisensePurification)
RAP⽅法是通过针对调控RNA设计互补⽣物素探针组，将RNA拉下来以后，与其共
同作⽤的RNA或蛋⽩质（RBPs）就会同时被纯化获取，最后将提取的RNA做⾼通量测序
或QPCR，从⽽得到与⽬标RNA互作的RNA类型；与此同时，RBPs可以开展westernblot
验证或者MS鉴定未知蛋⽩（RAP-MS）。
简单来说就是RAP是⽤circ/lncRNA的反向互补探针组去拉靶circ/lncRNA，再⼀起把
结合在circ/lncRNA上的miRNA（和蛋⽩）拉下来，做测序或者qPCR。
如果lncRNA/此⼈从RNA的QPCR（△ct<12），表达太低，就要⽤TRAP。TRAP是
包含了2个载体，⼀个是构建ncRNA-ms2融合RNA表达载体，另⼀个是GST-MS2蛋⽩融
合表达载体。MS2蛋⽩结合ms2颈环序列，GSH磁珠拉下MS2-GST，再进⾏检测。
技术应⽤：内源检测RNA与RNA，或RNA与蛋⽩相互作⽤关系。
技术要点：需要质量好的，且本底表达量⾼的RNA样品，如本底表达量低，需要升级为TRAP 检测。
7．Luciferase（双荧光素酶检测）
Luciferase是miRNA-靶基因研究中运⽤的最多的技术。值得注意的是，对于
lncRNA-miRNA，circRNA-miRNA吸附的研究，做Luciferase实验的时候还需要考虑到以下因素：挑选的lncRNA和circRNA本⾝是否具备作为分⼦海绵的功能。⽐如lncRNA表达
于细胞核内⽽不在胞质，或者它们与AGO2蛋⽩没有结合（AGO2是lncRNA/circRNA发挥
海绵作⽤的指⽰蛋⽩，分别与吸附的miRNA形成circRNA/lncRNA-miRNA-AGO2蛋⽩的三
元复合物）。所以在做双荧光素酶检测之前，你需要先做以下⼯作：
1)RIP-qPCR：检测lncRNA/circRNA是否与AGO2蛋⽩结合。
2)FISH：查看lncRNA/circRNA与miRNA的表达是否存在共定位。
风险提⽰：由于双荧光素酶载体不能成环，所以做circRNA/miRNA检测时并不能完全
模拟细胞内环境。
技术应⽤：
1外源检测miRNA与靶基因RNA3’UTR的结合；（推荐）
2外源检测miRNA与lncRNA/circRNA的结合。
3通常⽤⼯具细胞HEK-293（植物系统除外）细胞进⾏，不需要⽬的细胞检测。
技术要点：两个荧光素酶最好在同⼀个载体上，以做背景校正；靶向关系预测要精准；miRNA
的mimics最好带荧光，以排除转染效率问题。以上检测技术的适⽤性总结成⼀张表，如下：
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议