-基础研究-
及生物信息学分析
赛音朝克图'赵俊2罗彤$邓套图格'宋美丽彳艾丽雅彳阿茹娜'
I内蒙古自治区国际蒙医医院，呼和浩特010065；2北京中医药大学针灸推拿学院
100029；3内蒙古医科大学蒙医药学院，呼和浩特010110
通信作者：赛音朝克图，Email:saiyin2012@126
【摘要)目的分析慢性应激抑郁模型大鼠海马组织miRNA表达特征，探究与抑郁发作相关
的差异表达miRNA。方法将12只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组和模型组，每组
6只。对照组大鼠养，正常饮水摄食，不给任何刺激。模型组大鼠孤养，并给予8种不可预知的慢
性应激刺激28d，建立大鼠抑郁模型。利用旷场实验检测大鼠的抑郁行为，运用miRNA 4.0Array芯
片技术筛选出对照组和模型组大鼠海马间差异表达miRNA，利用Fisher精确检验，筛选出具有显著
性差异的miRNA，采用miRanda和TargetScan两个数据库对显著性差异miRNA分别进行靶基因预
测，取两种预测结果的交集，对差异表达miRNA利用GO数据库进行基因功能注释,KEGG数据库进
行信号通路(Pathway)注释。结果miRNA芯片技术分析结果显示，与对照组比较，模型组大鼠海马 组织中得到25条差异表达miRNA，其中上调的miRNA有15条(P<0.O5,FC>1.3)，下调的miRNA有
10条(P<0.O5,FC>1.3)。这些miRNA的靶基因主要参与细胞内信号转导、RNA聚合酶II启动子转
录的调节、DNA模板化、蛋白质磷酸化、大脑发育、心脏发育等生物学进程(P<0.01)o Pathway分析显
示，轴突导向和癌症通路的显著性水平最为显著，其次是AMPK信号通路、cGMP-PKG信号通路、神
经营养信号通路等抑郁发作的经典信号通路(P<0.05)。结论慢性应激抑郁模型大鼠海马miRNA
表达谱发生明显改变，差异表达的25条miRNA主要参与了轴突导向、神经营养信号通路等抑郁发作
密切相关的信号通路及癌症通路。
【关键词】抑郁症；海马；微小RNAs；靶基因；生物信息学
基金项目：国家自然科学基金项目(81760909)
D01:10.3760/cma.j371468-20200802-01625
Differential expression and bioinformatics analysis of miRNA in hippocampus of rats with chronic
stress depression
Saiyin Chaoketu1,Zhao Jun2,Luo Tong2,Deng Taotuge',Song Meili3,Ai Liya3Runa3
1International Mongolian Medicine Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region,Hohhot
010065,China；2S chool of Acupuncture and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing100029,
China；3S chool of Mongolian Medicine,Inner Mongolia Medical University,Hohhot010110.China
Corresponding author:Saiyin Chaoketu,Email:saiyin2012@126
[Abstract]Objective To analyze the expression characteristics of miRNA in the hippocampus of
rats with chronic unpredictable mild stress,and to explore the differentially expressed miRNA associated with
depressive episodes.Methods Twelve SPF male SD rats were randomly divided into control group and mod
el group,with6in each group.The rats in the control group were raised in groups,drank water and fed nor
mally without giving any stimulation.Rats in the model group were all orphaned and subjected to8kinds of
chronic unpredictable mild stress for28days.Open field experiment was used to detect the depressive be
havior of rats.The miRNA4.0Array chip technology was used to screen the differentially expressed miRNA
in hippocampus of rats in the two groups,and the target genes were predicted through miRanda and Tar
getScan databases,and the differentially expressed miRNA were analyzed for target gene function and KEGG
signal pathway.Results miRNA microarray analysis showed that compared with the control group,25differ
entially expressed miRNA were obtained in the hippocampus of model group,including15up-regulated
miRNA(P<0.05,FC〉l.3)and10down-regulated miRNA(P<0.05,FC>1.3).The target genes of these
miRNA were mainly involved in biological processes such as intracellular signal transduction,RNA polymerase II promoter transcription regulation,DNA templating,protein phosphorylation,brain development,and heart development(P<0.01).Pathway analysis showed that the significance level of axon guidance and cancer pathways were the most significant,followed by AMPK signaling pathway,cGMP-PKG signaling pathway, neurotrophic signaling pathway and other classic signaling pathways for depression(P<0.05). Conclusion The expression profile of miRNA in hippocampus of chronic stress depression model rats is significantly changed.The25miRNA differentially expressed are mainly involved in axon guidance,neurotrophic signaling pathways and other signaling pathways
closely related to depression episodes,as well as cancer pathways.
[Key words]Depression；Hippocampus；microRNA；Target gene；Bioinformatics
Fund program:National Natural Science Foundation of China(81760909)
DOI：10.3760/cma.j371468-20200802-01625
抑郁症已成为影响全球的心理健康问题，抑郁发作的持久的心境低落、兴趣缺乏、乐趣丧失、认知行为障碍以及自杀行为会给社会、个人、家庭带来巨大的经济损失和负担。我国抑郁症的终身患病率为6.8%⑴，但目前对抑郁症发病机制、客观诊断标记和高效这三个重要临床科学问题仍知之甚少⑵。海马是产生和调节情绪，调控情感、认知功能的关键脑区，与抑郁发生密切相关。抑郁症患者海马体积减小，海马组织代谢异常在抑郁发作的研究中获得较为一致的结论W microRNA（miRNA）是一类高度保守的长度约为18-25个核昔酸的内源性非编码单链RNA。miRNA通过与目的信使RNA结合直接或间接调控基因的表达。以往研究表明，miRNA表达异常与抑郁样行为发生◎句，海马神经可塑性⑺，神经信号通路〔旳，应激反应［⑼的关系密切。有研究显示，重度抑郁症患者外周血单核细胞中的miRNA表达与正常人相比具有显著差异小）。抗抑郁药可以改变抑郁症患者外周血液miRNA的表达［⑵。因此，寻与抑郁相关miRNA 以及被调控的关键靶基因十分必要。本研究通过慢性不可预知温和应激刺激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）建立大鼠抑郁模型，采用miRNA 4.OArray
芯片技术观察抑郁模型大鼠海马miRNA 的差异表达变化，利用GO分析和通路富集分析进行了差异表达miRNA的靶基因功能富集及信号通路显著性分析。
材料与方法
一、材料
1-实验动物：SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量（220±10）g，许可证号:SCXK（京）2016-0011，于北京中医药大学实验动物中心饲养，实验室许可证号:SYXK（京）2016-0038，自由摄食饮水，适应性饲养7d后进行实验。
2.主要试剂与仪器：PEXBIO细胞总RNA抽提试剂盒（批号:A010601，购于北京爱普拜生物技术有限公司）,FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit 试剂（批号：901911，美国Affymetrix公司），Gene-Chip®Hybridization Wash and Stain Kit染试剂（批号:900720，美国Affymetrix公司）。Hybridization Oven645基因芯片杂交炉（美国Affymetrix公司），Fluidics Station450型洗涤工作站（美国Affymetrix 公司），Scanner30007G基因芯片扫描仪（美国Affymetrix公司）,9700PCR荧光定量聚合酶链反应仪（美国ABI公司），GL-3250B型磁力搅拌器（其林贝尔公司），NanoDrop ND-2000分光光度仪（美国ThermoFisher公司），Affymetrix miRNA4.0Array芯片（美国Affymetrix公司）。
二、方法
1.大鼠分组及模型构建：根据文献［13-14］将12只雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组和模型组，每组6只。对照组6只大鼠使用一个大笼养，正常饮水摄食，不给任何刺激。模型组大鼠每只使用小笼孤养，并给予8种不可预知的应激刺激28d，制作大鼠抑郁模型。包括潮湿环境24h，禁食24h，昼夜颠倒24h，夹尾3min，笼位倾斜45。24h, 4七冷水游泳5min，禁水24h，水平摇晃30min，以上刺激每日只给予一种，同种刺激不能连续出现，且每种刺激最少出现2次。
2.旷场实验：将大鼠放入四周底面全部涂黑的无盖木制方箱（60cmx60cmx40cm），底面用白线划分为面积相等的25块。将大鼠置于敞箱底面的中心方格内，以大鼠穿越底面的方格数为水平运动次数（记录四爪均进入方格的次数），以后肢直立次数为垂直运动次数。分别记录应激刺激前1d和
应激刺激28d后的水平运动次数、垂直运动次数，每只大鼠测定时间为3min，每次实验结束后清理箱内残留物。
3.动物取材：行为学检测后各组大鼠使用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.4ml/100g)，断头取脑，剥去颅骨，充分暴露脑组织，将两侧顶叶掀起，分离、剥离、取岀海马分装在冻存管中，编号后放入液氮中速冻,-80T冻存备用。
4.总RNA提取及质检：使用PEXBIO Total RNA Extraction Kit试剂盒，按照说明书进行样品的总RNA抽提。使用NanoDrop ND-2000分光光度仪测定各标本总RNA浓度及纯度，取总量>130ng，浓度>17ng/(11,260/280在于 1.8-2.1之间的Total RNA样本进行后续的Affymetrix miRNA 4.0Array 芯片实验。
5.PolyA加尾.miRNA生物素标记、芯片杂交、洗脱及扫描：在样品中加入RNA Spike Control Oli-gos，按照Affymetrix Flashtag试剂盒标准流程配置Poly-A Tailing Master Mix，加入到上一步的Total RNA中,37X.15min，使用Affymetrix miRNA 4.0 Array芯片配套的FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit试剂盒标准流程对miRNA进行生物素标记。按照GeneChip®Hybridization Wash and Stain Kit试剂盒说明配置杂交液，利用GeneChip Hybridization Oven645基因芯片杂交炉，将生物素标记好的miRNA 分子进行杂交,48每分钟60转杂交16h。然后分别分装600|il stain1,600pj stain2,800pj Array Holding Buffer，通过GeneChip Fluidics Station450基因芯片洗脱工作站进行洗涤染芯片。使用GeneChip Scanner30007G基因芯片扫描仪进行扫描，并通过Affymetrix GeneChip Operating Software(GCOS)软件将信号转化，从而获得每个探针的信号值，生成CEL文件。
6.miRNA差异表达及基因功能与信号通路分析：采用miRanda和TargetScan两个数据库对显著性差异miRNA分别进行靶基因预测，最终取两种预测结果的交集，利用GO数据库得到的差异基因进行基因功能注释，KEGG数据库进行信号通路(Pathway)注释。
7.统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，数据以均数土标准差表示。利用Transcriptome Analysis Console(TAC),version:4.0.1标准化软件和limma R package(version:3.36.5)软件包来筛选差异表达miRNA，用t检验筛选两组差异表达miRNA。利用Fisher精确检验和多重比较检验计算每个功能的显著性水平(P值),FDR法调整多个比较的P值，以P<0.05且差异倍数>1.3为阈值。
结果
一、模型组与对照组大鼠抑郁行为比较
应激刺激前1d，对照组和模型组大鼠水平运动次数、垂直运动次数均差异无统计学意义(均P> 0.05)。应激刺激28d后，模型组大鼠水平运动次数、垂直运动次数与对照组比较显著降低，均差异有统计学意义(均P<0.05)o见表1。
表1各组大鼠水平运动、垂直运动次数比较
(社s，次，每组n=6)
组别
水平运动次数垂直运动次数
造模前造模后造模前造模后
对照组56.75±16.2542.23±28.0811.88±2.388.62±4.52
模型组53.63±21.7411.25±9.0411.87±3.51 4.36±3.08 f值 1.324 6.5460.4888.367
P值0.7590.0010.6460.000
二、两组大鼠海马组织miRNA质检结果
miRNA4.0Array芯片质检标准为样本Total RNA>1jig，浓度>17ng/山,260/280在 1.8-2.1范围之间。每组选取的3只大鼠海马组织miRNA抽提质检样品均符合miRNA4.0Array芯片进一步分析的要求。见表2。
表2各组样本miRNA质控表
样本名称浓度5卸)总量(唧OD260/OD280现有体积W)是否符合要求对照组」361.512.7 1.9535是
对黒组-2328.611.5 2.0935是
对照组・3225.97.9 2.0435是
模型组」339.011.9 2.0435是
模塑组・2418.914.7 2.0935是
模型组-3887.531.1 2.0735是
三、模型组与对照组大鼠海马组织miRNA差异表达谱
miRNA芯片技术分析筛选结果显示，与对照组比较，模型组大鼠海马组织有25个miRNA表达水平有显著差异，其中上调的15个，下调10个。根据P值与FC值绘制的火山图见图1。将25个差异表达的miRNA做无监督层次聚类分析(hierarchical clustering)，以热图(heatmap)形式显示。对照组和模型组差异表达的miRNA形成了明显的层次聚类
团，能看出两组上调miRNA和下调miRNA的表达变化。见图2。
-2-10
差异倍数
红代表上调miRNA，蓝代表下调miRNA
图1对照组和模型组大鼠海马组织差异表达
的25个miRNA火山图
模型细对I Btfl mo-«niR-449c-5(> mo-«niR-2lO-Sp mo^niR-156-Sp mo-wXR-219a-2-3p mo-«WA-3Sl-Sp mo^niR-503-5p mo-«niR-423-5p
mo-«niR-l94-3p mo-miR478
mo^ntR-37Q-5p mo-«rtR-55lb-Sp m<HniR4324
mo^««R-4U-3p mo^raR-130ft-3p mo-«niR-29b-3p mo-«niR-29c-3p mo-«niR-l33b-Sp mo^R-203»-3p mo-miA-IM-Sp
mo^reR-3Sl-3p mo-mR-5M-5p rrxHnifr3552
mo-miR-(325
火红代表上调miRNA，海蓝代表下调miRNA 图2对照组和模型组大鼠海马组织差异表达miRNA聚类图
四、基因功能显著性（GO）分析
通过Gene Ontology数据库，分别对上调miRNA 和下调miRNA进行基因功能注释。获得上调miRNA的24135个显著性差异靶基因,663个显著性功能（GO）和下调miRNA的16114个显著性差异靶基因，482个显著性功能（GO）。根据P值排序，上调miRNA和下调miRNA的前15个显著性生物学功能及富集到显著性功能上的差异表达基因数分布情况见表3和表4。
表3上调miRNA靶基因GO分析
（前15个显著性生物学功能）
G0W差异基因数P值
伽聚合SH启动子转录的正调控523 3.48X1O'30 DNA模板•转录的正调控3079.30x10-24 RNA聚合削启动子转录的负调控375 1.49x10②
由RNA聚合!O启动子进行转录217 5.92x107 DNA模板•转录359 2.13X10"14
生物学过程799 6.62x10'14
蛋白质磷酸化2498.88X10'14
细胞内信号转导209 1.04XIO'13
细瞬殖负调控195 2.75X10'13
积极调节GTPase的活性2W皿『2
大脑发育161I.67X10'12
细胞迁移1099.20X10'11
转化生长因子B受歸号通路49 1.41X1O'10
基因表达调控129 2.49x10」°
心脏发育149 3.85x10-'°
表4下调miRNA靶基因GO分析
（前15个显著性生物学功能）
GO名称差异基因数
RNA聚合酶11启动子转录的正调控432 5.00X10'25 DNA模板-转录的正调控244 3.21X10'16
mirna靶基因分析觥内信号转导1837.32x10小
积极调控GTPase的活性178 1.65x1严
生物学过程663 2.30X1043
蛋白质磷酸化2107.08X10'13
由RNA聚舗瞩动子进熊录175 1.60X10'12 RNA聚舗U启动子转录的负调控287 6.40XJO'12
心脏发育1337.16X10'12
蛋白质自身觴化92 1.63X10-11 DNA模板•转录的负调控212 6.93x10」
投射神经元发育75 6.34x10」°
大脑发育1引I.OlxlO'9
酪氨酸隣酸化61 1.26X10"9
子宫内瞬发育122 4.47X10'9
五、信号通路显著性（Pathway）分析
通过KEGG数据库，获得上调miRNA的125个Pathway和下调miRNA的135个Pathway0上调miRNA的最为显著性水平的前15个Pathway见图3。下调miRNA的最为显著性水平的前15个Path-way见图4。根据KEGG数据库，对富集得到的显著性信号通路进行分类，发现6个高级分类和30个中级分类，它们包含147个信号通路。6个高级分类中生物系统含有51个（35%）显著性信号通路，人类疾病含有38个（26%）、环境信息处理含有27个（18%）、代谢含有14个（9%）、细胞过程含有13个（9%）、遗传信息处理含有4个（3%）显著性信号通路。30个中级分类中信号传导含有25个（17%）
显
著性信号通路，其次为癌症含有20个（14%）信号通路，内分泌系统15个（10%），神经系统9个（6%），免疫系统8个（5%），最少的为氨基酸代谢，碳水化合物代谢、细胞活性、核昔酸代谢、感官系统和转录等，均含有1个（<1%）显著性信号通路。
轴突导向
癌症中的蛋白聚檯
Rapl信号通路
Wnt信号通路
MAPK信号通路
Ras信号通路
黑素生成
Hippo信号通路
CAMP信号通路
EGFROS氨酸激SS抑制剤的耐药
脑胶虎赠
ErbB信号通路
mTOR信号通路
磷脂信号通路
癌症通路
8101214161820
-lg(PM)
显著性筛选标准为P<0.05；橫轴：-lg（P值），-lg（P值）
越大信号通路显著性水平越高，纵轴:KEGG数据库中
信号通路名称
图3上调水平前15个miRNA-Pathway富集柱状图
上调基因信号通路富集
下调基因信号通路富集
显著性筛选标准为P<0.05；橫轴:-lg中（P值），-lg（P
值）越大信号通路显著性水平越高，纵轴：KEGG数据库
中信号通路名称
图4下调水平前15个miRNA-Pathway富集柱状图
讨论
抑郁症是最常见的精神障碍疾病之一，由于抑郁症发病机制的复杂性，可能涉及多种发病机制和多个易感基因。多项研究证实,5-轻胺信号通路相关基因，多巴胺信号通路相关基因，血管相关通路基因均与抑郁症的发生存在关联少〕。在神经系统中,miRNA通过调控相关靶基因参与学习、记忆、神经元重构及神经变性疾病的发生发展I"〕。本研究通过miRNA芯片技术观察对照组和模型组大鼠海马miRNA表达谱，得到25个差异有统计学意义的miRNA。
本研究结果显示，在慢性应激抑郁模型大鼠和对照组大鼠海马间获得具有上调显著性差异的15个miRNA和下调显著性差异的10个miRNA。其中miR-3552、miR-6324、miR-29c-3p、miR-29b-3p、miR-203a-3p的上调差异倍数和miR-194-3p、miR-210-3p、miRNA-15b-5p、miR-503-5p的下调差异倍数最为显著。有研究显示，给予SD大鼠电击足底、冰水游泳、热应激、摇晃、夹尾、禁水、禁食、昼夜颠倒等刺激28d后，筛选出对照组和模型组大鼠海马间表达差异达2倍以上的miRNA有13个，其中
miR-503和miR-15b的表达变化口刃与本研究结果一致。但是另有研究结果显示，给予SD大鼠14种不同轻度应激刺激35d，发现海马组织中miR-382-3p, miR-183-5p,miR-3573-5p,miR-202-3p,miR-493-3p 等5个miRNA显著上调，只有miR-370-3p下调显著［闵。很显然，抑郁症患者外周血和抑郁模型大鼠海马miRNA表达谱差异不完全一致。据此分析认为，抑郁症患者外周血与海马组织miRNA表达谱存在差异，而且不同刺激和刺激的持续时间不同，抑郁模型大鼠海马miRNA表达谱也存在差异。既往研究显示，重症抑郁障碍患者外周血中出现差异表达的miR-26b、miR-1972、miR-4485、miR-4498、miR-4743主要参与调控信号传导、各种器官的发育、调控细胞周期以及细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程❾］。也有研究报道称，抑郁症患者的血液、血浆或血清中的差异表达miRNA大多数靶向神经可塑性和神经发育途径⑵］。本研究结果显示，25个差异表达miRNA的靶基因主要参与细胞内信号转导、RNA聚合酶H启动子转录的调节、DNA模板化、蛋白质磷酸化、大脑发育、心脏发育等多种生物学进程。可见，以上研究结果具有一定的一致性。此外，本研究中出现的参与大脑发育、心脏发育生物
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