例数超过210万，致死人数年超过180万人。《中国肿
瘤学年报》［2］2019年发布的信息表明，预计至2020年，我国肺癌的发病人数将突破80万，肺癌致死人数将接
近70万。虽然肺癌的相较其它恶性肿瘤具有更
多样化的选择，尤其是靶向和免疫等手
段的革新，使肺癌的生存期不断得以突破，但是因为
肺癌的总体预后依然很差［3］。miRNA是一类由18-22
个核苷酸构成的非编码短链RNA，虽然其并不直接参
与基因编码功能但是人体内60%以上基因表达都受
到miRNA的调控。miRNA调控基因表达的机制在于
其可以和靶基因的信使RNA（mRNA）的3’非编码区
域（UTR）结合，抑制mRNA的翻译或者直接促进mRNA的降解，从而在转录后水平发挥基因沉默的效应［4］。miRNA的基因调控作用贯穿人体细胞从分裂到分化到恶变和凋亡等一系列过程，参与胚胎发育，个体生长，肿瘤形成和肿瘤消亡全过程。已证实一些特异的miRNA对于肺癌的发生、发展和转移等过程起着关键性的作用［5］。近年来，不少研究均发现血清miRNA的表达水平和肺癌的诊断和预后解读密切相关，甚至有望单独或者联合现有标志物作为肺癌诊断和预后判断的新方法，而肺癌的早期诊断对于提高患者的生存期具有重要意义［6］，本文就血清miRNA用于肺癌诊断及预后判断的最新进展进行综述。 1.1血清miRNA的生物学来源既往研究［7］认为循环miRNA尤其是血浆miRNA源于癌细胞在凋亡或者坏死之后细胞结构瓦解胞浆及胞核内的分子释放入血，或者经过巨噬细胞吞噬消化后残余的分子游离于血液之中，均属于被动释放入血的一种。部分研究［8］表明，血清中释放的游离miRNA分子可能是细胞的一种主动分泌行为所致：剪切成熟的miRNA可在胞浆内被亚细胞结构用脂质（包括类脂质）或者脂蛋白包裹，然后主动耗能分泌至细胞外并进入血液。血液中的游离miRNA可以被其他细胞经过细胞膜上受体识别并结合，通过细胞内吞的方式进入细胞后降解掉包被的脂蛋白或者脂质，于胞内释
放出miRNA进而继续发挥其调控功能。这一过程被视为是一种新的细胞间通讯方式，在调节机体内环境等环节发挥作用，也为血清miRNA的来源提供了一种新的理解机制。这种主动分泌机制下释放入血的miRNA可视为一种细胞间信号分子，这也为血清miRNA用于疾病的诊断进一步提供了理论支持。
1.2血清miRNA的常用检测方法血清miRNA可行的检测手段较多，但常用的方法为逆转录后聚合酶链式反应（RT-PCR）、基因芯片探针技术、克隆测序等等［9］。血清miRNA的的表达量总体处于比较低的丰度，因此灵敏度高，特异性强，成本控制性好，操作性强是血清miRNA检测应用秉持的原则，转录后聚合酶链式反应是目前应用最广的首选方法。不同于普通RNA的逆转录扩增，因为miRNA为仅仅只含有20个左右核苷酸的单链RNA，因此在miRNA合成cDNA时常采用茎环法（stem-loop）和polyA加尾法两种方法。检测时根据目标miRNA设计出的独特茎环结构和加尾结构，是逆转录后聚合酶链式反应高灵敏度和强特异性的保证，也大大提高了检测的可靠性和可重复性［10］。
2血清miRNA用于肺癌诊断的研究现状
2.1血清miRNA用于肺癌诊断的优势血清miRNA 用于肺癌诊断最大的优势在于易实施，创伤小。只需采集患者的血浆（清）即可进行检测，相较于穿刺等病
血清miRNA与肺癌的诊断及预后进展
殷敏，杜敏，刘彤
mirna靶基因分析
[摘要]肺癌是目前我国及全世界发病率最高的恶性肿瘤，同样也是导致死亡人数最多的恶性肿瘤。Mi⁃croRNAs（miRNAs）是一类长度为18至24个核苷酸组成的短链非编码单链RNA，参与了人体内60%以上基因表达和细胞内绝大部分信号通路的调控，在恶性肿瘤的发生发展过程持续扮演着重要角，同时miRNA也被证实其循环浓度可用于恶性肿瘤的诊断，预后判断甚至策略制定等多个领域。由于血清miRNA在肺癌的诊断中具有无创性优势，并兼具了一定的敏感度及特异性，为肺癌的诊断及预后判断的应用提供了新的方向。本文就血清miRNA用于肺癌诊断的最新进展进行综述。
[关键词]肺癌；血清miRNA；早期诊断；预后判断
[中图分类号]R466.11+2[文献标识码]A
[文章编号]1672-7193（2021）01-038-04Doi:10.3969/j.issn.1672-7193.2021.01.010
作者单位：610083四川成都，中国人民解放军西部战区总医院肿瘤科（殷敏、杜敏）、检验科（刘彤）
通信作者：刘彤，：************************
理活检其创伤性可以忽略不计，而且检测易实施，只
需普通的PCR仪器和配套的试剂盒即可开展［11］。血
清miRNA的另一大优势在于目标分子的稳定性，不同
于mRNA，miRNA对无处不在的核糖核酸酶（RNAse）
具有高度耐受性，可在血浆中长期保存，研究［12］表明miRNA即使在经历血液和组织反复冻融，加热，PH等理化条件改变的情况下依然保持相对稳定，依然能达
到可检测的要求，是一种较为理想和优秀的生物标志
物测候选分子。其次，血清miRNA在用于肺癌的检测
中表现出了良好的灵敏度和特异性，甚至对于肺癌不
同病理类型的诊断也具有参考意义。
2.2循环miRNA用于肺癌诊断的进展Weidong Wang等［13］研究团队发现了一个由12个miRNA组成的一个组合（miRNA-17、miRNA-146a、miRNA-200b、miRNA-182、miRNA-155、miRNA-221、miRNA-205、miRNA-126、miRNA-7、miRNA-21、miRNA-145和miRNA-210）可用于非小细胞肺癌（NSCLC）的早期诊断。该团队验证了该组合的诊断价值，并与传统肿瘤标志物和放射诊断进行了比较，并且构建了一个计算图表来预测NSCLC的风险。该研究入组了82名CT 扫描时发现肺部占位的患
者，随后这些患者接受了手术切除并明确了病理诊断。随后使用RT-PCR检测这些患者血清中特定miRNA的表达浓度。结果表明上述12个miRNA在NSCLC患者中的表达水平明显高于良性患者，经过验证，该组合的诊断特异性和阳性预测值分别为96.4和95.8%。随后该团队将此组合和传统肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA），神经烯醇化酶（NSE），和细胞角蛋白19片段21-1（Cyfra21-1）进行比较，发现该组合的诊断敏感度明显高于传统肿瘤标志物。最后该团队将上述12个miRNA的组合和临床常用的7个常用标志物整合到一个计算图表，其校准曲线显示预测概率和实际概率之间具有最佳一致性。该研究为血清miRNA用于肺癌的诊断提供了鼓舞人心的结果。
Jinchang Pan等［14］发现miR-33a-5p和miR-128-3p在肺癌组织和细胞系中表达水平均下调。同时miR-33a-5p和miR-128-3p在肺癌组织中的表达水平与肺癌的TNM分期呈现出显著相关性。肺癌组织中的miR-128-3p也与吸烟和肿瘤大小相关联。更重要的是，miR-33a-5p和miR-128-3p在肺癌患者和早期肺癌患者（TNM I-II期）血清中较健康对照组呈现低表达的态势，这一结果提示其对肺癌的早期诊断可能具有重要的意义。通过受试者特征曲线（ROC）的分析，miR-33a-5p和miR-128-3p单独或联合使用的ROC曲线下面积（AUC）值和敏感性/特异性均优于神经烯醇化酶（NSE）、糖类抗原-72-4（CA72-4）等传统肿瘤标志物。更重要的一点在于全血中的miR-33a-5p和miR-128-3p在不同的理化条件下均表现出高度稳定性，这些结果都表明全血中miR-33a-5p/miR-128-3p是肺癌早期检测较为理想的潜在候选标志物。
而Shaohua Lu等［15］人开展了大样本多中心研究，研究共纳入了1132个样本，这些样本从2008年10月至2014年9月间从五个中心招募而来，样本囊括了健康个体和已经获得病理确诊的肺癌患者。研究者利用基因微阵列技术从106个血浆样本中筛选出723个人类miRNA作为候选。然后利用RT-PCR技术检测候选健康个体和肺癌患者的miRNA表达情况，并以此进行大规模验证。结果表明有6个microRNAs（miR-17、miR-190b、miR-19a、miR-19b、miR-26b和miR-375）组成的诊断组合在区分肺癌患者和健康个体方面表现出了较高的诊断准确性（AUC分别为0.873和0.868）。更重要的是由三种miRNA组成的组合（miR-17、miR-190b和miR-375），在区分SCLC和NSCLC这两种重要的病理类型时显示了惊人的准确度（AUC分别为0.878和0.869）。该研究不仅发现了可用于临床诊断的血清miRNA组合，并且其结果提示血清miR⁃NA可能对于区分肺癌的病理类型具有重要的参考意义。
Hao-Min Zhang等［16］利用癌症基因组图谱（Can⁃cer Genome Atlas，TCGA）工具，对人肺腺癌的miRNA 表达谱数据谱进行差异分析，筛选出46个差异表达的miRNA，其中19个上调，27个下调，再采用Cox风险回归模型分析筛选出6种预后相关的miRNA，即hsa-miR-21、hsa-miR-142、hsa-miR-200a高表达、hsa-miR-101、hsa-let-7c、hsa-miR-378e低表达，进一步的相关临床数据分析发现hsa-miR-21高表达、hsa-miR-378e低表达的肺腺癌患者中位总生存时间（overall survival，OS）明显缩短（P＜0.05，AUC= 0.618）。miR-21和miR-378e与肺腺癌预后不良存在明显相关性，可作为肺腺癌预后的潜在分子标志物。
Helal F Hetta等［17］纳入40例非小细胞肺癌（NSCLC）患者和20例与患者组年龄、性别匹配的健康对照个体。使用RT-PCR技术对miRNA-17和miR⁃NA-222在血浆中的表达谱进行了评估，并确定了这两个标记物与临床病理特征的关系。结果表明，与健康对照组相比，NSCLC患者miRNA-17和miRNA-222水平显著升高。此外，研究发现肺癌转移患者的miR⁃NA-17水平较高，而无转移患者的miRNA-222水平较低。ROC曲线分析显示，miRNA-17的敏感度和特异性分别为77.78%和87.50%，miRNA-222的敏感度和特异性分别为50%和88.89%。该团队的研究提示miRNA-17和miRNA-222不仅可用于肺癌的诊断，而且可作为检测NSCLC患者早期肺癌和转移的非侵袭性生物标志物。
邓超等［18］纳入共计191例样本（其中96例确诊肺癌患者和95例健康对照个体），同样采用了RT-PCR 技术对三个miRNA（miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141）的血清表达水平进行检测，并用于临床特征分组和预后分析。结果提示肺癌组的miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141血清表达水平相较
于健康对照组明显下降，三种miRNA的诊断敏感度分别可达到为78.15%、54.71%和84.13%，特异度可分别达到68.41%、84.65%和75.32%。此外，研究者就miR⁃NA同患者的临床特征进行分析，发现miRNA-200b、miRNA-200c对于提示患者的肿瘤临床TNM分期具有统计学差异，而miRNA-141对于不同的病理分型和鳞状细胞癌抗原（SCC）水平具有区分意义。更重要的是研究发现miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141呈现高表达患者的3年生存率分别可以达到62.16%、58.14%、63.64%，而
低表达水平的患者三年生存率仅仅为23.73%、22.64%、25.40%，具有显著的统计学差异（P<0.05）。该研究证实了miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141不仅仅可用于肺癌的诊断，更可用于临床特征的预测和预后判断，为患者的提供辅助参考策略。
3小结
目前肺癌的诊断绝大部分基于影像学评估和病理活检的结果，对于肺癌的常规筛查，低剂量CT （LDCT）是目前备受推崇的影像学方法，但对患者机体有辐射影响，对于1mm-2mm以下病灶分辨能力差，对大型设备和影像科医师主观阅片能力过度依赖等不足［19］。而常规的病理学检查，譬如痰脱落细胞学检查阳性率太低，纤支镜检查适应范围较窄，检查过程患者不适感强，活检阳性率也并不令人满意。经皮肺部病变穿刺受限于医院CT机等影像学设备引导和临床医师经验，并面临咯血、气胸等并发症风险［20］。而循环miRNA检测具有的无创，便捷，兼具敏感性和特异性的优势，作为除了影像学和病理学检查之外重要的辅助诊断手段，具有广阔的前景和巨大的应用价值，尤其对于基层医院和社区单位用于肺癌的大样本初步筛查，具有重要的临床应用意义。目前世界范围内关于血清miRNA用于疾病诊断的研究层出不穷，尤其是恶性肿早期诊断的应用研究，因其临床价值巨大，吸引了包括世界顶尖医学中心和医药巨头的不懈投入，阶段性的研究成果已经在诸如美国临床肿瘤学会（ASCO）年会等业内权威的学术大会上予以发布并得到广泛认可。本文查阅分析了肺癌领域血清miR⁃NA研究的最新进展，几项研究都具备样本数量可观、设计合理、数据分析科学的特点，这些研究
均证实miRNA用于肺癌诊断具有较高的敏感度和特异性，AUC曲线分类效果明确，大部分单个miRNA对于肺
癌患者和健康患者的区分阳性率和特异度均可达到90%以上，对于肺癌的病理类型和预后判断更是显示出了相当的潜力。且这些研究都指明了血清miRNA 用于肺癌诊断的必然发展趋势和方向：即多个miRNA 组成一个诊断组合，能更加优化其检测能力，提高敏感度和特异性，或者与诸如CEA等现已成熟应用的肺癌生物分子标记物联合应用，能进一步提高其临床诊断效能。
虽然血清miRNA在肺癌的检测中具有重要的潜在应用价值，但很遗憾的是目前尚未在临床大规模开展并成为标准的检测方法之一，原因可能在于血清miRNA的检测面临如下亟需解决的两个问题。一是目前大部分的相关研究尚缺乏可靠的重复性，而一项成熟精准的检测技术对可重复性具有极高的要求，所以我们仍需要一些大规模大样本多中心多分层的研究进一步支持，而此类研究耗时费力，科研经费消耗大，短时间内很难大量产出研究成果。二是在逆转录后聚合酶链式反应中尚缺乏标准的内参照物，无法统一量化表达丰度，也无可供临床应用的标准检测平台和检测试剂盒。从理论研究到临床大规模应用推广的医学转化产出是一个漫长的过程，成熟的检测试剂盒的研发尚需时日。但目前曙光已经初现，早在几年前复旦大学樊嘉院士领衔的团队从高达900多例的样本中筛选出7个miRNA组成的诊断组合，用于肝癌患者的早期诊断［21］，该团队历经9年的转化医学研发，其应用型产品“7种微小核糖核酸肝癌检测试剂盒”已经问世，只需采集0.2mL血浆，对于肝癌的快速诊断敏感度和特异性可分别
达到84%和88%。该研发模式为肺癌的诊断提供了可借鉴的参考意义，尤其是目前肺癌已经成为我国发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，肺癌早期诊断miRNA试剂盒的研发意义重大。
总之，血清miRNA检测具有的无创，便捷，高敏感性和特异性使其在肺癌的诊断领域具有非常广阔的前景。目前的血清miRNA检测的趋势是几个特异性的miRNA组成一个组合联合诊断，相较于单一miR⁃NA可以大大提高敏感度和特异性，我们期待在经历更多的大样本数据研究和试剂盒优化开发后血清miRNA的检测能进入临床，单独或者联合目前现有检测技术，为肺癌的早期精准诊断和健康人初步筛查提供巨大的应用价值。
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（收稿日期：2020-08-07修回日期：2020-09-15）
（责任编辑：黄和祥）
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