激光生物学报ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol. 30 No. 1 Feb. 2021
第30卷第1期
2021年2月
王 道a，朱洪怡b，楚 毅b*
（中南大学湘雅二医院 a. 妇产科；b. 消化内科，长沙 10011）
摘 要：微小RNA（miRNA）是疾病发生发展过程中的调节剂，但其在炎症反应、免疫应答，特别是肿瘤中的调控机制仍然未知。本研究先对人类miR-146a-5p进行定位，分析序列保守性，挖掘其在不同组织中表达特征； 同时，将Targetscan7.1、miRDB、mirDIP和DIANA TOOLS数据库预测的人类miR-146a-5p靶基因取交集，并通过String11.0构建了蛋白相互作用（PPI）网络；利用Omicshare平台和KOBAS数据库进行基因本体（GO）注释分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果显示：人类miR-146a-5p成熟序列的保守性高，推测其具有重要生物学功能；73个靶基因涉及到结构分子活性、催化活
性以及转录因子活性配体的激活，并且参与机体代谢、信号传导、正负向调控等生物学过程；还与Toll样受体（TLRs）信号、核转录因子-κB（NF-κB）以及视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）等相关信号通路相关联。本研究初步阐明了人类miR-146a-5p通过调控靶基因在肿瘤发生、免疫应答和炎症刺激等疾病发生发展过程起着重要作用，人类miR-146a-5p将可能成为潜在的生物标记物和靶标。
关键词：人类；miR-146a-5p；靶基因；生物信息学；靶标
中图分类号：Q344 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2021.01.010 Target Gene Prediction and Bioinformatic Analysis of hsa-miR-146a-5p
WANG Dao a, ZHU Hongyi b, CHU Yi b*
(The Second Xiangya Hospital, Central South University a. Department of Obstetrics and Gynecology;
b. Department of Gastroenterology, Changsha 410011, China)
Abstract: MicroRNA (miRNA) is a key regulator in the processes of disease development, however its regulatory mechanism in inflammatory reaction, immune response, especially in tumors is still unknown. In this study, we firstly predicted and analyzed the location, sequence conservation of hsa-
miR-146a-5p aiming to get deep insight into the expression level in different tissues. Meanwhile, the target genes of hsa-miR-146a-5p were predicted by Targetscan7.1, miRDB, mirDIP and DIANA TOOLS. Addi-tionally, protein-protein interaction (PPI) network was constructed through String 11.0. Gene ontology (GO) and Kyoto encyclo-pedia of genes and genome (KEGG) pathway enrichment analysis were performed on Omicshare platform and KOBAS databas-es. The results have indicated that the mature sequences of hsa-miR-146a-5p was highly conserved, with important biological functions. The 73 target genes intersect mainly involved transcriptional activity, structural molecular activity, catalytic activity, and activation of transcription factor active ligands. The significantly enriched biological processes included metabolism, signal transduction, positive or negative regulation, and they were related to Toll-like receptors pathway, NF-κB pathway, RIG-I like receptors and other signaling pathways. Our study was preliminarily conducted to elucidate that hsa-miR-146a-5p participates in tumorigenesis, immune response and inflammatory stimulation by regulating target genes, which would be a novel biomarker and therapeutic target.
Key words: human; miR-146a-5p; target gene; bioinformatic; therapeutic target
（Acta Laser Biology Sinica, 2021, 30(1): 075-083）收稿日期：2020-06-10；修回日期：2020-08-23。
基金项目：国家自然科学基金项目（31670178）；湖南省自然科学基金项目（2017JJ3436）。
作者简介：王道，主管技师，主要从事生殖免疫学研究。
* 通信作者：楚毅，主治医师，主要从事消化道内镜诊断研究。E-mail:*************。
激光生物学报
第 30 卷
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由18到22个核苷酸组成的短RNA分子［1］，可以调节转录后基因的表达并且促进个体发育、细胞分化、机体炎症、免疫反应和癌变［2-6］等过程。这些分子通过与相应的mRNA相互作用从而形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），能够结合到3'非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）的互补序列，引起表达失调进而破坏信号传导途径增加人类患疾病的风险［7］。此外，许多研究报告表明miRNA 是基因表达的关键调节剂，将可能成为生物标记物的候选者［8］。
人类miR-146a-5p（hsa-miR-146a-5p）自2006年被David Baltimore实验室在小鼠中鉴定发现后，其功能被一些研究证实在多种类型的癌症中起抑制基因的作用［9-10］。但是，还有研究表明miR-146a-5p 在多种类型的癌症中起癌基因作用［11-12］。目前研究人员仍然对miR-146a-5p引起肿瘤的分子机
制非常感兴趣，如Li等［13］对miR-146a-5p在各种恶性肿瘤中的预后价值进行全面荟萃分析，提出miRNA可能是早期预测癌症的突破口。
本研究中我们采用多种生物信息数据库提取hsa-miR-146a-5p的靶基因数据交集，并对其进行全面的基因本体（gene ontology，GO）注释分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析，为未来对miR-146a-5p的靶基因分类鉴定及其在疾病中扮演的角提供新的研究线索。
1 材料与方法
1.1 hsa-miR-146a-5p的定位和序列保守性的预测分析
利用UCSC（genome.ucsc.ed）等在线数据库查hsa-miR-146a-5p的碱基序列、染体定位、物种保守性等基本信息；miRbase（/）在线数据库搜寻hsa-miR-146a-5p在染体的分布位置；使用Clustal Omega软件分析16个不同物种如智人（Homo sapiens）、黑猩猩（Pan troglo-dytes）、小家鼠（Mus musculus）、褐家鼠（Rattus nor-vegicus）、青鳉（Oryzias latipes）、家兔（Oryctolagus cuniculus）等的成熟序列的碱基信息并预测其保守性（表1）。1.2 hsa-miR-146a-5p在人类不同组织中的表达分析
运用miGator v3.0数据库（mirgator.obic. re.kr/）检索hsa-miR-146a-5p在人类不同组织器官中的表达量，并且进行预测分析。该数据库的测序数据均来自已发布的肿瘤基因图谱（The Cancer Ge-nome Atlas，TCGA）等的多个人类miRNA数据集。
1.3 hsa-miR-146a-5p靶基因以及编码蛋白质间的相互作用分析
通过最新版PubMed（bi.nlm.nih. gov/）检索近年来发表文献得出，hsa-miR-146a-5p在转录后水平上介导调控相应的靶基因，涉及参与了一系列疾病的发展和预后疗效的评价（表2）。采用 Targetscan7.1（ /vert71/）、miRDB（/）、mirDIP（ophid. utoronto.ca /mirDIP /index confirm.jsp）和DIANA TOOLS（diana. Imis. /Diana-Tools/index.php）4个在线靶基因预测工具预测靶基因，并用Venny 2.1（bioinfogpb.csic.es/tools/ venny /index.html）绘制4个数据库预测靶基因的韦恩图，取交集作为下一步靶基因数据集。将此数据集导入String 11.0数据库（）进行蛋白互作预测分析，然后结合Cytoscape-v3.6软件构建靶基因编码的蛋白间相互作用（protein-pro-tein interaction，PPI）网络图。
1.4 hsa-miR-146a-5p靶基因的GO注释分析和KEGG富集分析
运用Omicshare平台工具（icshare. com/）对韦恩图的交集靶基因进行GO注释分析。基
于超几何分布计算原理，从基因功能的3个方面：细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP），得到具有统计学意义的GO注释显著性分析（P<0.05）。同时，利用KOBAS数据库（kobas.cbi.pku.edu）对交集靶基因进行KEGG通路相关的具有统计学意义的富集分析（P<0.05为显著性阈值）。
2 结果与分析
2.1 hsa-miR-146a-5p的定位和序列保守性分析
在线检索miRBase、UCSC数据库发现hsa-miR-146a-5p基因序列号为MIMAT0000449，定位于人类基因组chr5q33.3染体（图1），其基因位点在chr5:160485373～160485393之间。通过miR-
第1
期图1 hsa -miR -146a -5p 在人类基因组中所处的位置
Fig. 1 The location of hsa -miR -146a -
5p in the human genome
图2 不同物种miR -146a -5p 的成熟序列
Fig. 2 Mature sequence of miR -146a -5p in different species
Base 在线数据库检索miR-146a-5p 成熟序列，结果显示，已知的22个不同物种中存在成熟序列。我们下载了智人、小家鼠、褐家鼠、青鳉、家兔等16个不同物种的成熟序列（图2）。Clustal Omega 软件预
测结果表明，hsa-miR-146a-5p 成熟序列“UGAGA-ACUGAAUUCCAUGGGUU ”在16个物种之间具有高度的保守性（表1），提示hsa-miR-146a-5p 可能具有潜在的生物学功能。
王道等：人类miR -1 a -5p 靶基因预测及生物信息学分析
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2.2 hsa-miR-146a-5p 在人类各组织的表达分析
hsa-miR-146a-5p 在人体部分组织器官的表达情况见图3，其中在淋巴细胞表达丰富程度最高，但是在其他组织中的表达量很低。2.3 hsa-miR-146a-5p 的靶基因预测结果
利用新版PubMed 、
EBSCO 快速全面检索相关文献，纳入结果的文献表明hsa-miR-146a-5p 调
控相应的靶基因参与了多种疾病以及多条信号通路（表2）。选用TargetScan 、miRDB 、mirDIP 和DIANA TOOLS 4个在线数据库预测的靶基因个数分别为283、488、828和853。最后通过在线软件Venny 2.1对上述4个数据集合绘制韦恩图推导靶基因交集（图4），以备后续数据分析，具体见表3。
表2 hsa -miR -146a -5p 调控的靶基因参与人类疾病
Tab. 2 hsa -miR -146a -5p target genes involved in human disease
miR-146a-5p expression Target gene
Disease Biological function
Up-regulation NF-κB1 ［25］
Oral cancer Inhibit proliferation, activate apoptosis of cancer cells Up-regulation CCL2 ［14］
Lung cancer Inhibit proliferation and promote apoptosis Up-regulation Rac1 ［15］
Prostate cancer Inhibit invasion and migration in cancer cells Up-regulation Sox5 ［9］
Breast cancer Impair tumor cell proliferation and migration Up-regulation RP A3 ［16］
Liver cancer Induce apoptosis and inhibit proliferation of tumor Up-regulation TRAF6 ［
26］
Osteoarthritis Induced chondrocyte apoptosis Down-regulation OTUD7B ［17］
Macular degeneration Inhibit neovascularization Up-regulation
MDM2 ［
18］
Colorectal cancer
Blocks cell-cycle progression
表1 不同物种miR -146a -5p 成熟序列
Tab. 1 Mature sequence of miR -146a -5p in different species
Sequence ID Species Name
Base sequence
MIMAT 0000449Homo sapiens hsa-miR-146a-5p 21-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-42MIMAT 0000158Mus musculus mmu-miR-146a-5p 6-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-27MIMAT 0012746Monodelphis domestica mdo-miR-146a-5p 15-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-36MIMAT 0006203Macaca mulatta mml-miR-146a-5p 21-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-42MIMAT 0000852Rattus norvegicus rno-miR-146a-5p 17-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-38MIMAT 0001163Gallus domesticus gga-miR-146a-5p 16-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-37MIMAT 0021775Anolis carolinensis aca-miR-146a-5p 9-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGC-29MIMAT 0007230Ornithorhynchus anatinus oan-miR-146a-5p 31-UGAGAACUGAAUUCCACGGGUU-52MIMAT 0022963Sus scrofa
ssc-miR-146a-5p 11-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-32MIMAT 0038171Alligator mississippiensis ami-miR-146a-5p 16-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU-36MIMAT 0022635Oryzias latipes ola-miR-146a-5p 23-UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGGUA-47MIMAT 0046462Xenopus lae
vis xla-miR-146a-5p 1-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGU-21MIMAT 0036567Tupaia chinensis tch-miR-146a-5p 1-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-22MIMAT 0032371Salmo salar ssa-miR-146a-5p 1-UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGG-23MIMAT 0047016Cavia porcellus cpo-miR-146a-5p 1-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUUG-23MIMAT 0048253
Oryctolagus cuniculus
ocu-miR-146a-5p
1-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUUG-23
9
第1
期图3 hsa -miR -146a -5p 在各个组织器官中的表达情况Fig. 3 Expression analysis of hsa -miR -146a -5p in organs 表3 hsa -miR -146a -5p 调控的靶基因数据集
Tab. 3 Target gene data sets regulated by hsa -miR -146a -5p
No.Target gene No.Target gene No.Target gene No.Target gene No.Target gene 1IGSF116KLF731ESYT246ZNF36761BMPR1A 2CDKN2AIP 17EIF4G232GDNF 47PRKAA262ZFYVE13ZBTB218USP333APPL1
48CDS163ERBB44IRAK1
19WWC2
34ZNF652
49ROBO164SRSF125SLC10A3
20FBXO2835SEC23IP 50HIPK365ABL26HNRNPD 21CARD1036C16orf7251PPP1R1166CCDC67ZDHHC13
22STRBP
37SIAH252LRRC1567LRP28NOVA123ZNF53238SORT153RABGAP168ARMC89TRAF624SCN3B 39LCOR
54PRX 69RIMS210TMEM120B 25VASN
40ZNRF3
55RFX7
70PTGFRN 11RARB 26DCAF1241MMP1656SAMD8
71SEMA3G 12LFNG 27PTPRA 42GALNT1057DDHD172GRID1
13CD80
28FBXW243SYT1
mirna靶基因分析
58ZNF512B 73
PIP5K1B
14ACKR229ZNRF244TBC1D2059MYT115
NUMB
30
BCORL1
45
MYBL1
60
XKR4
2.4 靶基因编码蛋白质间的相互作用预测
将4个数据库预测到的靶基因交集导入String
11.0，分析靶基因编码蛋白质间的相互作用。然后，将String 11.0分析结果结合Cytoscape_v 3.8.0软件构建PPI 图。PPI 结果显示，
hsa-miR-146a-5p 的靶基因编码蛋白质间形成了复杂的网络互作图。红连
线代表比绿打分相对较高，说明蛋白相互作用更强；蓝圆圈代表靶基因编码的蛋白节点（图5）。2.5 hsa-miR-146a-5p 的GO 注释分析
将韦恩图交集得到的73个靶基因格式整理后提交到Omicshare Tools 平台。GO 注释分析结果表明：hsa-miR-146a-5p 靶基因主要富集于细胞，包括
王道等：人类miR -1 a -5p 靶基因预测及生物信息学分析
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