HPV16L1VLP纯化、鉴定及血凝抑制实验方法的建立 邵迪，王燕，谷鸿喜*，韩聪，李茉，商庆龙，李承刚(哈尔滨医科大学微生物学教研室，黑龙江省普通高校病原生物学重点实验室，黑龙江哈尔滨150086)
摘要通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达H PV16L1VLP，纯化鉴定后利用其建立血凝抑制实验，检测HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。利用重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞表达HPV16L1蛋白，大量获得V LP；优化扩增蛋白的条件并用SDS-PAGE分析鉴定；经氯化铯密度梯度离心法纯化VL P；利用所得VLP建立血凝抑制试验，鉴定制备的HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。优化蛋白表达条件结果显示，当重组杆状病毒感染细胞的M O I=10时目的蛋白表达量最大；按此滴度感染悬浮培养的昆虫细胞，收获、纯化VLP并鉴定其特异性；利用所得VLP建立了血凝抑制实验，鉴定HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制效价为1B16。建立的血凝实验，可用于鉴定和检测HPV16L1相关抗体，为H PV诊断试剂的开发提供实验基础。 关键词人乳头瘤病毒16型；悬浮培养；病毒样颗粒;H PV16L1单克隆抗体；血凝抑制
中图分类号Q93-33文献标识码A文章编号1005-7021(2007)02-0029-04
HPV16L1VLP Purification and Identification
and the E stablish m ent of H e maggl uti nation Inhibition A ssay
SHAO D,i WANG Yan,GU H ong-x,i HAN Cong,L IM o,
SHANG Q ing-l o ng,LI Cheng-gang
(T e ach.&R es.S ect.ofM i crobiol.H arbin M e d.Un i v.K e y L ab.for Pa t h o g e n.O r g anis m s of
H e l ong ji ang C o mm on In st.ofH i gher L e arning,H arbi n150081)
A bstrac t T hrough express i on syste m of i nsect cell s t o express human pap ill omav irus(HPV)L1v irus-li ke parti c le (VLP)hem agg l uti na tion i nh i b iti on assay w as establis hed and usi ng it t o test its hem agg l uti na tion acti v ity ofH PV16L1 m onoc l ona l an tibody(M c A b)after pur ifi cation and i den tificati on.U sing i nsect ce lls suspensively cu ltured and i n fec-ted w ith recomb i nan t baculov irus to express H PV16L1pro te i n,VLP w ere obta i ned i n g rea t quantit y,opti m ized the cond iti ons of prote i n a m plifi cation ana l y zed and i dentified w ith SDS-PAGE,and then purified the V LP w it h C s C l g ra-d i ent cen trifug ati on and establi shed he m agg l uti nati on i nh i b iti on assay usi ng ob tained V LP to i dentify he m agg luti nati on i nhibiti on ac ti v ity of the prepared HPV16L1.T he resu lts of the opti m ized expressi on o f prote i n showed t ha tw
hen M O I =10hours t he i nfected ce lls w ith reco m b i nant baculov i rus the expressi on a m ount o f target pro tein w as the largest. W ith this titer i nfected the s uspens i ve l y cu ltured i nsec t ce lls,harv ested and purifi ed VLP and i dentified its spec ificity. T he valence of M c A b i dentified w ith purified VLP s by hem agg l uti nation i nh i bition assay w as1B16.T he established he m agg luti nati on assay can be used to i dentify and testH PV16L1correlated anti body and prov i de an assay f oundati on for HPV diagnosis kits and furthe r dev elopment.
K eywords hu m an pap illo m av irus(HPV)type16;suspensi on cu lt ure;v irus-li ke partic l e;he m agg l uti nati on i nh i b-i ti on
生殖道的人乳头瘤病毒(hum an pap illo m avir-us,HPV)感染十分常见。大量的临床、流行病学和实验室资料证实，宫颈癌组织中H PV16的检出率约占60%左右[1]。H PV用常规方法很难培养和大量制备。病毒结构蛋白在真核细胞中表达的L1蛋白能够自我装配成病毒样颗粒(v irus-
收稿日期:2006-11-02
作者简介：邵迪女，硕士研究生。现从事病原微生物学研究。
项目来源：黑龙江省攻关课题(GB02C111)；哈尔滨市重点攻关项目(04AA3CS176-1) *通讯作者29
微生物学杂志2007年3月第27卷第2期J OURNAL OF M ICROBIOLOGY M ar.2007V o.l27N o.2
li k e particle,VLP)[2]。以VLP作为肿瘤疫苗载体，具有免疫原性强、安全无毒、易于提纯及大量生产、接种方式多样等优点，而日益受到重视和广泛关注。本实验通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统大量表达HPV16L1VLP，并建立以此为抗原的血凝抑制试验，利用其检测本室制备的H PV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性，为H P V诊断试剂开发提供理论和实验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒、菌株和细胞r B ac V/H P V16L1重组杆状病毒为本室构建[4];Sf9昆虫细胞，由本室保存。
1.1.2主要试剂H P V16L1单克隆抗体，由本室制备；低熔点琼脂糖(昆虫细胞培养级)，可溶性两性霉素B，中性红，购自Sig m a公司;G race昆虫细胞培养基粉末，购自i n v itr ogen公司；胎牛血清，购自杭州四季青公司;CsC I，蔗糖，购自Am er-asco公司。
1.1.3动物8~12周B ALB/c小鼠(采血用)由哈医大二院动物试验中心提供。
1.2方法
1.2.1昆虫细胞悬浮培养在含10%的胎牛血清Grace.s培养液中转速为60~80r/m in，细胞接种密度为(3@105~5@105)/mL,27e条件下培养昆虫细胞。每隔24h测定一次细胞密度及存活率，绘制Sf9细胞生长曲线。用0.4%台盼兰染法测定细胞存活率，确定细胞生长对数期，为后期大量制备蛋白做准备。
1.2.2重组病毒滴度测定及确定常规方法用昆虫细胞大量扩增重组杆状病毒，用空斑试验测定病毒滴度(pfu/m L)。
MO I值按下列公式进行计算:
所需要加入的病毒体积(mL)
=预定的M O I(pfu/ce lle)@总的细胞数病毒滴度(pfu/mL)
1.2.3贴壁培养的昆虫细胞优化蛋白表达条件
100mL培养瓶内接种7@106个Sf9细胞，将病毒按MO I=5、10、15感染Sf9细胞，在72h收获细胞，离心收集沉淀。经SDS-P AGE电泳分析各滴度的蛋白表达量后，确认扩增蛋白的最佳病毒滴度。
1.2.4收获感染细胞用重组杆状病毒以MO I =10感染悬浮培养的昆虫细胞,72h收获细胞。1000r/m i n离心15m i n，收集表达蛋白质的细胞共计2@109个细胞。将细胞沉淀冻存于-80e 待用。
1.2.5VLP的纯化与鉴定裂解Sf9，经氯化铯密度梯度离心法纯化VLP及W estern b l o t鉴定其特异性。参照文献[3]进行。
1.2.6小鼠红细胞血凝集实验采BALB/c小鼠球后血,EDTA抗凝,1000r/m i n离心5m i n弃上清。用10mL0.1%BSA-PBS缓冲液3次洗涤红细胞，并配制成1%(体积比)悬液。取50L L 红细胞悬液分别与倍比稀释后的等体积H PV-16 VLP混合，分别加入血凝板各孔中，放置4e, 3h后分析结果，判断H PV16VLP凝集鼠红细胞的最低浓度。
1.2.7小鼠红细胞血凝抑制实验H P V16L1单抗与2倍体积的红细胞混合,4e过夜以除去单抗腹水中的非特异凝集素,4e1000r/m in离心5m in，弃红细胞。单抗腹水加热56e,30m i n 以除去腹水中的补体活性。将倍比稀释后的单抗50L L分别与能凝集鼠红细胞的H PV16VLP最低浓度50L L混合加入血凝板，置37e1h，再加入等体积1%(体积比)红细胞，混合后放置4e,3h后观察分析结果，判断单抗的血凝抑制效价。
2结果
2.1测定扩增病毒的滴度
空斑试验测定扩增病毒的滴度为2.5@109 pfu/mL。
race实验
2.2Sf9细胞生长曲线绘制
悬浮培养S f9细胞初始密度为3@105个/ mL，分别于24、48、72、96h台盼兰染活细胞计数，据此绘制出生长曲线(图1)。
2.3L1蛋白表达条件的优化
按MOI=5、10、15感染昆虫细胞,72h收获细胞,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达量，考马斯亮兰染后用B and Scan软件分析目的蛋白占总蛋白的百分含量，结果表明:MO I=5、10、15感染昆虫细胞表达蛋白得到的目的蛋白占总蛋白百分
30微生物学杂志27卷
比分别为24.3%、31.8%、31.3%(图2)
。
图1 Sf9细胞悬浮培养生长曲线
Fi g .1 Gro w th curve of S f 9cell s i n s u s pen sion cu lt ure
2.4 悬浮培养昆虫细胞扩增蛋白表达量测定
选择MOI =10感染悬浮培养的Sf9细胞,72h 收获VLP 。图2为悬浮培养的昆虫细胞72h 的L1蛋白表达量，用Band Scan 软件分析目的蛋白占总蛋白的百分含量，结果表明悬浮培养昆虫细胞按MO I=10扩增蛋白得到的目的蛋白占总蛋白百分比为40.8%。
2.5 病毒样颗粒的分离及检测
超速离心后，取第16~33层液体进行SDS -PAGE 分析及W ester n b l o t 检测，结果显示：在第
18到30层可见到目的条带，分子量为57ku ，且
同抗体发生特异性反应。根据B ACKMAN 超速离心机说明书计算,26层附近应为浮力密度1.29g /c m 3[4]
即VLP 所在处，经SDS -PAGE 及W estern blot 证实该处有特异性目的条带(图3)。
图2 晚期蛋白L1在昆虫细胞中表达
的优化及悬浮Sf9细胞中表达HPV16L 1
蛋白的SDS -PAGE 分析
F i g .2 Op ti m iz ati on of caps i d protei n L1expressed
i n S f 9cell and t he express i on ofHPV16L1protei n s
i n S f 9cell i n s u s pen sion
1:Lysates of S f 9(negati ve control);2:Lys ates of S f 9i n sus p ension harbori ng rBac V /HPV16L1(M O I=10);3:Lysat es of S f9harbori ng r B ac V /H P V16L1(M OI=5);4:Lysat es of S f9harbori ng r B ac V /H P V16L1(M OI=10);5:Lysat es of S f9harbori ng r B ac V /H P V16L1(M OI=15);M:Protei n l ow MW marker (97.4、66.2、43.0、31.0、20.1
ku)
图3 氯化铯密度梯度离心后各搜集区w estern b lot 检测(第16~33层)
F i g .3 Anal ysis of pu rified VLP w i th W estern b lot after Cs C l cen trif ugati on (Fracti ons 16~33)
2.6 小鼠红细胞血凝集实验结果
将1%小鼠红细胞悬液与递倍稀释的
H P V16L1VLP 4e 共同孵育,3h 后观察结果。结果第6孔为VLP 使鼠红细胞呈/++0凝集的最高稀释倍
数，即含一个病毒单位，则VLP 凝集效价是1B 256(表1)。进行血凝抑制实验时，使用4个病毒单位，将VLP 按1B 64(728.91ng /
孔)稀释。
2.7 血凝抑制实验结果
取728.91ng /孔的VLP ，与不同倍比稀释的H P V16L1单克隆抗体进行红细胞凝集抑制试验，结果在第4孔处即1B 16稀释倍数时红细胞凝集现象完全被抑制，此稀释度为H P V16L1单克隆抗体的血凝抑制效价(表2)。
31
2期 邵迪等:H PV 16L1VLP 纯化、鉴定及血凝抑制实验方法的建立
表1小鼠红细胞血凝集实验结果
Tab le1Res u lt ofH P V16L1VLP b i nding i nh i b i ti on assay
反应板孔号1
红细胞对照
12345678
VLP稀释倍数1B81B161B321B641B1281B2561B5121B1024-VLP浓度/(ng#孔-1)5831.252915.631457.81728.91364.45182.2391.1145.56-
凝集结果++++++++++++++++++++++++-
表2小鼠红细胞血凝抑制实验结果
Tab le2R esult of he m aggl u ti nati on i nh i b iti on assay
反应板孔号
VLP对照单抗对照红细胞对照12345678
单抗稀释倍数1B21B41B81B161B321B641B1281B256---
凝集结果----++++++++++++++--
3讨论
研究H PV预防性基因工程疫苗时发现H P VL1基因表达的L1蛋白具有中和表位，能刺激机体产生抗体具有中和保护作用[5]。因而，以表达L1蛋白制备H PV预防性疫苗已成为目前国际上研究的热点。通过真核细胞表达系统表达的H P V16L1蛋白可自我组装成病毒样颗粒(v irus-li k e particle,VLP)[2],VLP与天然病毒具有类似的立体构象。大量研究已表明VLP具有良好的免疫原性和反应性，可诱导机体产生高滴度的中和抗体[6]。本研究即利用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达VLP，以此建立血凝抑制实验来鉴定H P V16L1单克隆抗体的血凝抑制活性，为研制基因工程亚单位疫苗奠定基础[7]。
本实验采用悬浮培养技术培养Sf9昆虫细胞。按照MOI值=0.1~0.2[3]感染细胞,48~72 h收获获得了高达109p f u/mL的重组病毒液，并采用CsC l密度梯度超速离心法获得到了纯化的VLP。为了检测VLP是否有红细胞凝集作用，进行了H PV16L1VLP红细胞凝集试验，结果证实H P V16L1VLP能够凝集小鼠红细胞。Roden 等[8]报告H PV6b、11、l6、18、31均能凝集鼠红细胞，说明血球凝集现象是乳头瘤病毒VLP的一个普遍活性，并推测H P V16L1VLP也能与鼠红细胞膜上的一种蛋白受体结合。由于目前尚无有效的体外检测系统检测特异抗体能否中和H P V，因此，本实验利用VLP血凝抑制实验来检测本室制备的H PV16L1单克隆抗体的中和活性。其原理可能是抗体能与VLP正确地结合即能阻止VLP 与红细胞表面结合[8]。本实验结果证明H P V16L1单抗能识别VLP表面构象位置，并具有血凝抑制活性。Zheng等[9]以棉尾兔乳头瘤病毒样颗粒(CRPV VLP)的实验提示，免疫血清具有抗CRPV VLP引起的小鼠红细胞凝集活性与其保护性免疫紧密相关，这与本实验结果和意义相同。参考文献:
[1]Bosch FX,M anos MM,M unoz N,et al.Prevalence of hum an
papill o m avirus i n cervi cal can cer:a w orl dw i de pers p ecti ve.In-
ternati onal b i o l og i ca l study on cervical can cer(IBSCC)Study
G roup[J].J N atlC ancer I n st,1995,87(11):796-802.
[2]K i rnbau er R,T aub J,G reenstone H,e t al.E ffi cient s elfas-
s e m b l y ofhum an papill o m av i ru s type16L1and L1L2i n t o virus
li k e parti cl es[J].J V iro,l1993,67(12):6929-6936. [3]魏兰兰，谷鸿喜，初明，等.人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1
的表达及病毒样颗粒的装配[J].中华微生物学和免疫学
杂志,2004,24(5):383-384.
[4]魏兰兰，韩立，任皎，等.人乳头瘤病毒16型结构蛋白在
昆虫细胞中的表达[J].中华实验和临床病毒学杂志,2001,
15(4):309-313.
[5]包广宇，谷鸿喜，商庆龙，等.H P V16L1重组蛋白的纯化及
免疫原性的实验研究[J].中华实验和临床病毒学杂志,
2005,19(2):164.
[6]Kou t sky L A,Au l t KA,W heeler C M,e t al.A con trolled tri a l of
a hum an pap illo m avirus t ype16vacci ne[J].N Eng l J M ed,
2002,347(21):1645-1651.
[7]Sch iller J T.Pap illo m avirusli ke particl e vacci n es f or cervi cal
cancer[J].M olM ed Today,1999,5(5):209-215.
[8]Roden RB,H ubbert NL,K irnbauer R,et al.Pap illo m avirus L1
caps i ds aggluti natem ouse eryt h rocyt es t h rough a protei naceoous
receptor[J].J V i ro,l1995,69(8):5147-5151.
[9]Zheng J,S i L,Song J,et a l.Enhan ced i m mune res pon s e to
DNA b ased H P V16L1vacci nati on by costi m u latory mo l ecule B-
72[J].Anti viral Res,2003,59(1):61-65.
32微生物学杂志27卷
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