浙江大学学报（农业与生命科学版） ３７（１）
：４０～４８，２０１１
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ａｇｒｉｃ畅＆ＬｉｆｅＳｃｉ畅）
文章编号：１００８‐９２０９（２０１１）０１‐００４０‐０９
ＤＯＩ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８‐９２０９．２０１１．０１．００６
收稿日期：２０１０‐０４‐１０
基金项目：农业部公益行业专项资助项目（ＮＹＨＹＺＸ０７‐０５６）；转基因重大专项资助项目（２００８ＺＸ０８００１‐００２）． 作者简介：曹燕飞（１９８６—），女，安徽合肥人，硕士研究生，主要从事分子植物病理学研究．
通信作者：陈功友，男，教授，从事植物‐病原物互作功能基因组学研究．Ｔｅｌ：０２５‐８４３９５０２８；Ｆａｘ：０２５‐８４３９９００２；Ｅ‐ｍａｉｌ：
ｇｙｏｕｃｈｅｎ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．
曹燕飞１
，邹丽芳２
，赵文祥１
，纪志远１
，邹华松２
，陈功友
１，２
（１．南京农业大学植物保护学院农业部病虫监测与治理重点开放实验室，江苏南京２１００９５；２．上海交通大学农业与生物学院，上海２００２４０）
摘 要：水稻细菌性条斑病菌存在至少２０个ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族成员，但其在水稻上的毒性或无毒性贡献并不清楚．本文依据ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ结构上的保守性，利用同源重组策略，
借助自杀性载体ｐＫＭＳ１介导，对水稻条斑病菌中的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因进行敲除．结果发现：同源交换可通过基因内和基因间重组实现ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族的基因敲除；ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示，水稻条斑病菌中有５个ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因被成功敲除，表明水稻条斑病菌ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因敲除体系构建成功．这为逐一评价ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因的毒性或／和无毒性功能奠定了基础．关 键 词：水稻条斑病菌；ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因；基因敲除；遗传重组中图分类号：Ｑ７８；Ｓ４３２．１ 文献标志码：Ａ
ＣＡＯＹａｎ‐ｆｅｉ１，ＺＯＵＬｉ‐ｆａｎｇ２，ＺＨＡＯＷｅｎ‐ｘｉａｎｇ１，ＪＩＺｈｉ‐ｙｕａｎ１，ＺＯＵＨｕａ‐ｓｏｎｇ２，ＣＨＥＮＧｏｎｇ‐ｙｏｕ１，２（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄＩｎｓｅｃｔｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２４０，Ｃｈｉｎａ）ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｋｎｏｃｋｏｕｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｏｆＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａ
ｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ａｇｒｉｃ畅＆ＬｉｆｅＳｃｉ畅），２０１１，３７（１）：４０‐４８
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｔｌｅａｓｔｔｗｅｎｔｙｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｉｎＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ（Ｘｏｃ）ｔｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｒａｖｉｒｕｌｅｎｃｅｉｎｒｉｃｅｉｓｓｔｉｌｌｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ．Ｂａｓｅｄｏｎ
ｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｆａｍｉｌｙ，ａｍａｒｋｅｒ‐ｅｘｃｈａｎｇｅｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｓｔｒａｔｅｇｙｉｎ
ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｍｅｄｉａｔｉｏｎｂｙａｓｕｉｃｉｄｅｖｅｃｔｏｒｐＫＭＳ１ｗａｓｕｓｅｄｔｏｋｎｏｃｋｏｕｔｔｈｅａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｏｆＸｏｃ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｏｔａｌｆｉｖｅａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｇｅｎｅｓｗｅｒｅｇｒａｄｕａｌｌｙｋｎｏｃｋｅｄｏｕｔｂａｓｅｄ
ｏｎｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｆａｍｉｌｙｂｙｕｓｉｎｇｍａｒｋｅｒ‐ｅｘｃｈａｎｇｅｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙａｓｕｉｃｉｄｅｖｅｃｔｏｒｐＫＭＳ１．Ｔｈｅｋｎｏｃｋ‐ｏｕｔｍｕｔａｔｉｏｎｏｃｃｕｒｒｅｄｅｉｔｈｅｒｗｉｔ
ｈｉｎａｎａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｇｅｎｅｏｒｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｇｅｎｅｓ．ＰＣＲａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｋｎｏｃｋ‐ｏｕｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｇｅｎｅｓｏｆＸｏｃｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｐｌａｔｆｏｒｍｔｏａｓｓｅｓｓ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｒ／ａｎｄａｖｉｒｕｌｅｎｃｅｒｏｌｅｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｂｙｅａｃｈｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｆａｍｉｌｙｉｎｒｉｃｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ；ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｆａｍｉｌｙ；ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
曹燕飞，等：水稻条斑病菌ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因敲除体系的建立
水稻条斑病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ，Ｘｏｃ）属稻黄单胞菌稻生致病变种，引
起的水稻细菌性条斑病（简称条斑病）是世界上热带和亚热带地区发生的重要细菌病害之一，对我国南方稻区水稻安全生产构成严重威胁［１］．Ｘｏｃ通过气孔进入水稻叶肉组织，侵染为害薄壁
细胞，不进入维管束，受叶脉限制而形成条斑症状［２‐３］．已有的研究结果显示，水稻条斑病菌与水稻互作，虽然存在毒性分化现象［１］，但因存在 基因对基因＂关系的抑制因子［４］，水稻上缺乏像抗白叶枯病那样有明显 基因对基因＂关系的抗条斑病的抗性资源；因此，水稻条斑病的防治因没有很好的抗性品种利用而难度增大．
基因组序列测定结果显示，水稻条斑病菌在水稻上的毒性分化主要由ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族的基因数量决定．菲律宾菌株ＢＬＳ２５６和ＢＬＳ３０３中分别存在２８个和３３个ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因［５］，而中国菌株ＲＳ１０５中至少存在２０个ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因［６‐８］．根据水稻白叶枯病菌ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因功能的研究结果推测，水稻条斑病菌中含有的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因大多可能呈数量效应，在Ｘｏｃ‐水稻互作中某个ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因对寄生适应性（ｆｉｔｎｅｓｓ）、毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）和侵袭力（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ）的贡献可能会被遮盖，当缺失或补加某个ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因进行毒性测定时，其在症状学上的微小变化很难辨别和定量，除非它表现为无毒性功能．这给评价Ｘｏｃ中ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因的毒性贡献带来很大困难．虽然通过插入突变可以获得某个ａｖｒＢｓＡ／ＰｔｈＡ的突变体，但这并不能排除Ｘｏｃ菌株中其他众多ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因在毒性方面的贡献以及相互作用；因此，建立逐一敲除ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因的技术体系，使Ｘｏｃ不含或少含ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因，可能是评价ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因毒性和无毒性功能的有效途径．
无毒的
水稻条斑病菌中的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因，同其他植物病原黄单胞菌一样，在结构上具有高度的保守性．ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因的５ 端和３ 端具有几乎一样的酶切位点，ＤＮＡ‐ＤＮＡ间的同源性达９７％以上；ＡｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ的Ｎ端含有高度保守的Ⅲ型分泌系统（Ｔ３Ｓ）分泌信号；中间区域是几乎完全相同的由３４个氨基酸组成的直接重复单元，重复单元的第１２和１３位氨基酸是可变的，Ｃ端含有亮氨酸拉链结构
（ＬＺ）、３个核定位信号（ＮＬＳ）和酸性转录激活区域（ＡＤ）［９‐１３］．ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因间的差异主要表现在３４个氨基酸重复单元的重复数和第１２位和第１３位氨基酸种类的差异上．由于ＡｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ蛋白通过Ⅲ型分泌系统（Ｔ３ＳＳ）进行分泌，通过ＮＬＳ进入寄主细胞核，借助第１２位和第１３位的氨基酸识别结合寄主中ＵＰＡ基因特定启动子区域，具有转录因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅ，ＴＡＬ）功能，因此，ＡｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族蛋白也称为ＴＡＬ效应分子［１４‐１５］．据此推测，获得含有１个或不含ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ的Ｘｏｃ菌株，对于鉴别对应寄主中的ＵＰＡ基因具有重要的科学意义．
实现高度同源的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因突变，目前主要有２种方式：转座子插入和基因敲除．姜佳等［１６］和王寅鹏等［１７］研究发现，利用ｐＫＭＳ１载体可以实现Ｘｏｃ的ｈｒｐ基因敲除．本研究利用该系统，将ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因的５ 和３ 端保守区域作为同源臂构建在ｐＫ
ＭＳ１载体上，成功实现了ＲＳ１０５菌株中的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因敲除，获得了５个近等基因菌系；根据ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果推测，ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因敲除位置可以发生在基因内，也可以发生在基因间．水稻条斑病菌ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因敲除体系的建立，对全局性揭示该病菌的毒性变异机制以及与水稻的互作关系具有重要的科学意义．
１ 材料与方法
１．１ 供试菌株、质粒及生长条件
本研究所用的质粒和菌株见表１．水稻条斑病菌生长于ＮＡ固体和ＮＢ液体培养基中，２８℃培养［１８］；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ）于ＬＢ培养基中３７℃培养．基因敲除所用的培养基ＮＢＮ和ＮＢＳ参见文献［６］．培养基中相应抗生素质量浓度为：氨苄青霉素（Ａｐ）１００μｇ爛ｍＬ－１，卡那霉素（Ｋｍ）２５μｇ爛ｍＬ－１，利福平（Ｒｉｆ）１００μｇ爛ｍＬ－１．１．２ 敲除载体的构建
为了实现ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因的逐一敲除，根据ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因保守的５ 和３ 端，选
１４
第１期
浙江大学学报（农业与生命科学版）
择不同的同源臂位置，构建可实现５次基因敲除的敲除载体ｐＫＭＳＡ１，ｐＫＭＳＡ３，
ｐＫＭＳＡ４，ｐＫＭＳＡ５和ｐＫＭＳＡ６．引物组合以及同源臂大小见表２和图３Ｂ．以ＲＳ１０５的基因组ＤＮＡ作为模板，分别ＰＣＲ扩增相应的左右同源臂，产物纯化后连接至ｐＭＤ１８‐Ｔ载体上，转化ＤＨ５α，ＰＣＲ和酶切验证得到相应阳性克隆，回收经相应酶切（表２）后的左右同源臂片段，连接至ｐＫＭＳ１载体上，再次转化ＤＨ５α，经
ＰＣＲ和酶切验证得到相应的敲除载体（表１）．
表１ 实验用菌株和质粒
Ｔａｂｌｅ１ Ｓｔｒａｉｎｓａｎｄｐｌａｓｍｉｄｓｕｓｅｄ
菌株或质粒特 性来源Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ
ＪＳＢ２‐２４利福平抗性，野生型菌株本实验室
ＳＣＢ０４‐２利福平抗性，野生型菌株本实验室
ＲＳ１０５利福平抗性，野生型菌株，中国小种２号本实验室
ΔＲ１利福平抗性，缺失ａｖｒ基因的ＲＳ１０５突变体本研究
ΔＲ２利福平抗性，缺失ａｖｒ基因的ＲＳ１０５突变体本研究
ΔＲ３利福平抗性，缺失ａｖｒ基因的ＲＳ１０５突变体本研究
ΔＲ４利福平抗性，缺失ａｖｒ基因的ＲＳ１０５突变体本研究
ΔＲ５利福平抗性，缺失ａｖｒ基因的ＲＳ１０５突变体本研究
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αφ９０１ａｃＺΔｍ１５，ｒｅｃＡ１Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
质粒
ｐＭＤ１８‐Ｔ氨苄青霉素抗性，ｐＵＣ１８衍生物，ＴＡ克隆载体，２６９２ｂｐＴａＫａＲａ
ｐＵＡＶ４５ｋ卡那霉素抗性，携有ａｖｒＸａ３基因的ｐＵＦＲ０３４李玉蓉，等［８］ ｐＫ
ＳＭ１卡那霉素抗性，ｓａｃＢ＋，ｍｏｂ，ｏｒｉＶ，ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｆｒｏｍｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ，６．４ｋｂ本实验室
ｐＫＭＳＡ１卡那霉素抗性，一个来自ａｖｒ基因大小为８５７ｂｐ融合片段的ｐＫＳＭ１本研究
ｐＫＭＳＡ２卡那霉素抗性，一个来自ａｖｒ基因大小为３９４ｂｐ融合片段的ｐＫＳＭ１本研究
ｐＫＭＳＡ３卡那霉素抗性，一个来自ａｖｒ基因大小为１０６６ｂｐ融合片段的ｐＫＳＭ１本研究
ｐＫＭＳＡ４卡那霉素抗性，一个来自ａｖｒ基因大小为９３１ｂｐ融合片段的ｐＫＳＭ１本研究
ｐＫＭＳＡ５卡那霉素抗性，一个来自ａｖｒ基因大小为９５０ｂｐ融合片段的ｐＫＳＭ１本研究
表２ 所用引物和ＰＣＲ扩增条件
Ｔａｂｌｅ２ ＰｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
引物序列（５ →３ ）酶切位点ＰＣＲ产物大小／ｂｐｐ ‐ＡＣＴＡＧＴ ｐ
ｐＫＭＳＡ１‐５Ｒ５ ‐ＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧ‐３ ＨｉｎｄⅢ
ｐＫＭＳＡ１‐３Ｆ５ ‐ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＣＧＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧ‐３ ＨｉｎｄⅢ５１６
ｐＫＭＳＡ１‐３Ｒ５ ‐ＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＴ‐３ ＳａｌⅠ
ｐＫＭＳＡ２‐Ｆ５ ‐ＡＣＴＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＧＧＣＴＡ‐３ ＳｐｅⅠ３９４
ｐＫＭＳＡ２‐Ｒ５ ‐ＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＴＣＡＡＡＣＡＣＣＧＧＡＴＣＡＧ‐３ ＳａｌⅠ
ｐＫＭＳＡ３‐Ｆ５ ‐ＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣ‐３ ＳｍａⅠ１０６６
ｐＫＭＳＡ３‐Ｒ５ ‐ＴＡＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡ‐３ ＸｂａⅠ
ｐＫＭＳＡ４‐５Ｆ５ ‐ＴＡＡＣＣＣＧＧＧＧＴＡＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＣＧＣＴＡＧ‐３ ＳｍａⅠ５８０
ｐＫＭＳＡ４‐５Ｒ５ ‐ＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＴＣＧＡＡＣＧＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴ‐３ ＨｉｎｄⅢ
ｐＫＭＳＡ４‐３Ｆ５ ‐ＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＧＣＣＴＡＧＣＣ‐３ ＨｉｎｄⅢ３５１
ｐＫＭＳＡ４‐３Ｒ５ ‐ＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＧＣＴＣＣＡＴＣ‐３ ＸｂａⅠ
ｐＫＭＳＡ５‐５Ｆ５ ‐ＴＡＡＣＣＣＧＧＧＧＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＣＧＡＣ‐３ ＳｍａⅠ４５０
ｐＫＭＳＡ５‐５Ｒ５ ‐ＴＴＡＧＧＴＡＣＣＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧＴ‐３ ＫｐｎⅠ
ｐＫＭＳＡ５‐３Ｆ５ ‐ＴＴＡＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＣ‐３ ＫｐｎⅠ５００
ｐＫＭＳＡ５‐３Ｒ５ ‐ＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＣＡＣＧＣＴ‐３ ＸｂａⅠ
注：序列中的下划线处为限制性酶切位点．
２４第３７卷
曹燕飞，等：水稻条斑病菌ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因敲除体系的建立 应用Ａｘｙｇｅｎ公司细菌基因组试剂盒提取Ｘｏｃ基因组ＤＮＡ．ＰＣＲ扩增在ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＰＣＲ仪
（ＡＧ２２３３１ＨａｍｂｕｒｇＥｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上进行．ＰＣＲ反应体系：２．０μＬ１ｎｇ爛ｍＬ
－１
ｇＤＮＡ模板，４．０μＬ１０ｐｍｏｌ引物，１
Ｕｒ‐Ｔａｑ酶，１２．５μＬＧＣ缓冲液，２μＬ２５
ｍｍｏｌｄＮＴＰ，终体积２５μＬ．ＰＣＲ反应条件：
９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性４５ｓ，５８℃退火４０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ．ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳后通过
凝胶成像系统（ＧｅｌＤｏｃ２０００ＴＭＢＩＯＲＡＤ，ＵＳＡ）分析含量．ＤＮＡ提取、酶切、电泳、Ｔ４ＤＮａｓｅ连接、转化等参照文献［１９］．
１．３ 基因敲除
Ａ：融合ＤＮＡ被构建到载体ｐＫＭＳ１上；Ｂ：在左端或右端臂上发生的第１次重组交换；Ｃ：在含１０％蔗糖培养基上进行的第２次重组交换；Ｄ：目标基因被敲除．阴影部分表示ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因左右２端臂；黑箭头表示引物结合位点及延伸方向；灰箭头表示卡那霉素基因．
图１ 借助携带ｓａｃＢ基因的自杀性载体ｐＫＭＳ１以２
步重组策略敲除水稻条斑病菌中的ａｖｒＢｓ３／
ｐｔｈＡ基因
Ｆｉｇ．１ Ｔｗｏ‐ｓｔｅｐｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｋｎｏｃｋｏｕｔａｖｒＢｓ３／
ｐｔｈＡｇｅｎｅｓｉｎＸ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａｂｙｕｓｉｎｇａ
ｓｕｉｃｉｄｅｖｅｃｔｏｒｐＫＭＳ１ｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｓａｓａｃＢｇｅｎｅ
将目标基因左右２端臂ＰＣＲ扩增后融合构建在ｐＫＭＳ１载体上（图１Ａ），将重组质粒按照Ｌｅａｃｈ等［９
］的方法电转导入ＲＳ１０５菌株中．由于ｐＫＭＳ１载体的ｏｒｉＶ不能在黄单胞菌中
复制（资料未发表），因而在含Ｋｍ的ＮＡＮ平板上生长的就为发生了第１次同源交换的重组子（图１Ｂ），即重组载体借助某一同源臂整合在细菌基因组中．借助ｐＫＭＳ１载体上的ｓａｃＢ作用，在含１０％蔗糖的ＮＢＳ平板上生长、但对应在含Ｋｍ的ＮＢＳ平板上不生长的即为发生了第２次同源交换（图１Ｃ）．由于２次同源交换有可能发生在目标基因的２个臂上，ＳａｃＢ在１０％蔗糖中具有自杀能力，这样目标基因ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因左右同源臂之间的ＤＮＡ被敲除（图１Ｄ）．１．４ ＰＣＲ检测
为了筛选和检测ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因敲除突变体，将左端臂的上游引物和右端臂的下游引物（表２）进行组合，通过菌落‐ＰＣＲ方式进行ＰＣＲ扩增，以相应敲除载体为阳性对照．若ＰＣＲ产物大小与预计敲除片段相减的理论值吻合，则表明目标ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因被成功敲除．ＰＣＲ反应体系和反应条件同１．２节．１．５ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交验证
对ＰＣＲ检测显示为正确的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因敲除突变体进行基因组ＤＮＡ提取，以ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因的共有ＳｐｈⅠ片段（图３）为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析．探针的标记、预杂交和杂交见ＤＩＧ试剂盒操作手册．
２ 结果与分析
２．１ 水稻条斑病菌中ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因
的数量
为了精确分析水稻条斑病菌中的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因数量，本文选择江苏和四川来源的ＪＳＢ２‐２４和ＳＣＢ０４‐２菌株与模式菌株ＲＳ１０５进行比较．根据ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族基因５ 和３ 酶切位点的保守性（图３），分别对测试菌株ＲＳ１０５、ＪＳＢ２‐２４和ＳＣＢ０４‐２的ｇＤＮＡ进行ＢａｍＨⅠ酶切，以ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因中间的ＳｐｈⅠ片段为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交．杂交结果显示，供试菌株中均存在众多的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因（图２）．对相同杂交信号条带位置比较结果显示，ＪＳＢ２‐２４和ＳＣＢ０４‐２菌株中的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ数量多于ＲＳ１０５的，主要表现在
３
４ 第１期
浙江大学学报（农业与生命科学版）
６ｋｂ以上和２．８ｋｂ以下的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因上．在３．２ｋｂ处，３个菌株的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因数量有所不同，如ＲＳ１０５菌株中有ｑ条带，但在ＪＳＢ２‐２４和ＳＣＢ０４‐２菌株中则不存在（图２）．这提示，水稻条斑病菌不同菌株中的不同ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因可能在毒性变异和强弱方面
起重要作用．
Ａ：代表菌株ＪＳＢ２‐２４、ＳＣＢ０４‐２和ＲＳ１０５的基因组ＤＮＡ经ＢａｍＨⅠ酶切后的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ数量分析；Ｂ：模式菌株ＲＳ１０５的基因组ＤＮＡ经ＳｐｈⅠ酶切后的ａｖｒＢ
ｓ３／ｐｔｈＡ数量分析．Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；（ａ～ｔ），（１～２０）：根据
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果推测的ＲＳ１０５菌株中所含的ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因数目．
图２ 水稻条斑病菌不同菌株携带ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基
因数量的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析
Ｆｉｇ．２ ＮｕｍｂｅｒｓｏｆａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｇｅｎｅｓｉｎＸ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．
ｏｒｙｚｉｃｏｌａｒｅｖｅａｌｅｄｂｙＳｏｕｔｈｅｒｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌＳｐｈⅠｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｔｈｅＸａ３ｇｅｎｅａｓｔｈｅｐｒｏｂｅ
为了说明杂交信号条带强可能存在多个ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因和精确计算ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因数量，本文对ＲＳ１０５菌株的ｇＤＮＡ进行ＳｐｈⅠ酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交．杂交结果显示，ＲＳ１０５菌株中存在至少２０个ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因（图２Ｂ），其中最大的ＳｐｈⅠ片段为４．５ｋｂ．根据ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ的保守性结构推测，该４．５ｋｂ的ＳｐｈⅠ片段对应的ａｒｖＢｓ３／ＰｔｈＡ基因大小应该为６．４ｋｂ左右，对应的ＢａｍＨⅠ片段大小为６．２ｋｂ（图２Ａ）．因ＳｐｈⅠ片段主要由１０２ｂｐ重复单元构成，由此推测，ＲＳ１０５菌株中的最大ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因的１０２ｂｐ重复单元在
基因内至少重复４０次以上．由于ＪＳＢ２‐２４和ＳＣＢ０４‐２菌株中ＢａｍＨⅠ片段的杂交信号条带大于ＲＳ１０５菌株的６．２ｋｂ条带（图２Ａ），由此推测ＪＳＢ２‐２４和ＳＣＢ０４‐２菌株中的最大ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因大于ＲＳ１０５菌株的．２．２ ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ家族的多个基因被敲除 按照ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因结构上的保守性（图３Ａ），分别获得进行第１次至第５次敲除的左右同源臂．同源臂的位置（图３Ｂ）和大小（表２）兼顾到基因敲除的推测位置．获得的左右同源臂融合后构建在ｐＫＭ１载体上，进行第１次至第５次基因敲除的融合片段大小分别为８５７、３９４、１０６６、９３１和９５０ｂｐ，相应的敲除载体分别为ＰＫＡ１、ＰＫＡ２、ＰＫＡ３、ＰＫＡ４和ＰＫＡ５（图３Ｂ）．ＰＣＲ扩增和敲除载体的酶切电
泳验证未显示．
Ａ：ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因结构示意图；Ｂ：ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ左端臂（ＬＦ）和右端臂（ＲＦ）融合后构建在ｐＫＭＳ１载体上获得重组载体ＰＫＡ１～ＰＫＡ５．其中Ｂ：ＢａｍＨⅠ；Ｐ：ＰｓｔⅠ；Ｓ：ＳｐｈⅠ；ＮＬＳ：核定位信号．
图３ ａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡ基因结构及左右同源臂位置
Ｆｉｇ．３ ＳｃｈｅｍａｔｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｇｅｎｅｓｉｎＸ．
ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｌｅｆｔａｎｄｒｉｇｈｔａｒｍｓｆｌａｎｋｉｎｇａｖｒＢｓ３／ｐｔｈＡｇｅｎｅｓ
将重组载体ＰＫＡ１通过电转化方式导入受体菌ＲＳ１０５中，经在含有Ｋｍ的ＮＡＮ平板上筛选，获得了具有Ｋｍ抗性、发生第１次同源重组的交换子；经在含有１０％蔗糖的ＮＡＳ培养基上生长，借助ｓａｃＢ基因作用，获得了对蔗糖具有抗性而对Ｋｍ敏感的第２次同源重组的交换子．利用第１次敲除的融合片段上游引物ｐＫＭＳＡ１‐５Ｆ和下游引物ｐＫＭＳＡ１‐３Ｒ（表２）进行ＰＣＲ验证，发生２次同源交换的重组子的
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４第３７卷
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