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刘娟张俊辉王芹周影钱_祝长杰*
（吉林省蚕业科学研究院，吉林吉林132012）
摘要蛹"草菌的保藏方法对柞蚕蛹"草的产量及活性物质含量影响较大，随着冷冻保藏时间的延长，蛹"草菌注蛹后的生产能力逐渐降低；随着冷藏保藏时间的延长，蛹"草菌注蛹后的生产能力及"草素含量均逐渐降低。丰富培养基和PDA培养基中蛹"草菌随继代培育次数的增加其生产能力均出现降低的现象，但PDA培养基中降低的速度较慢，故PDA培养基更适合蛹"草菌的保藏。 关键词蛹"草菌菌株保藏生产能力
柞蚕蛹虫草中含有丰富的蛋白质及氨基酸，蛋白质含量为30%，氨基酸含量为22%，还含有冬虫夏草所不含有的抗癌物质虫草素，所以蛹虫草是冬虫夏草的良好替代品。在柞蚕蛹虫草的批量生产中，蛹虫草菌的保藏方法对柞蚕蛹虫草的产量及活性物质含量影响较大。本蛹虫草菌的方方蛹虫草菌生产能力的影响作一探讨。
1材料与方法
1.1供试材料
蛹虫草菌，柞蚕蛹，均由吉林省蚕业科学研究院提供。PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（potato dextrose agar medium, PDA）；丰富培养基：葡萄糖2%，蛋白—2%，磷酸钠0.25%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸镁0.075%，马铃薯15%；米饭培养基：大米20%，大麦35%，糙米20%，黄豆25%。
1.2试剂与仪器
试剂：乙猜、甲醇购于美国Fisher试剂公司，虫草素标准品购于国药集团。仪器:Agilent1290超高效液相谱仪，KOKUSAN H-19F离心机,0.45“m水系滤膜等。1.3试验方法
1.3.1蛹虫草菌冷冻保藏
蛹虫草菌接种于米饭培养基中，接种量为15%，待蛹虫草菌长满米饭培养基后继续培养10d，放置于一19C冷冻保藏。
1.3.2冷冻保藏蛹虫草菌活化
取一19C冷冻保藏的蛹虫草菌，放置于一4C的环境中进行活化12h再应用于试验中。
1.3.3柞蚕蛹虫草培育
取固体培养基上生长旺盛、转能力强的蛹虫草菌菌块（约黄豆粒大小）接种于100mL PDA液体培养基中，23C避光、120r/min摇床培养96h，得到蛹虫草菌菌丝球悬液。每只柞蚕蛹接种量为0.2〜0.3mL。在适当培养条件下进行柞蚕蛹虫草的培育（吉林省蚕业科学研究院专利技术），测定蛹虫草菌的僵化率和出草率，得到柞蚕蛹虫草。
1.3.4蛹虫草菌继代培育
取PDA固体培养基上生长旺盛、转能力强的第1代蛹虫草菌约黄豆粒大小，再次接种于PDA固体培养基中，23C避光培养至蛹虫草菌全部覆盖培养基后见光培养，此为第2代菌株，依次继代培养至第6代菌株，即得到蛹虫
作者简介：刘娟（1991—），女，硕士，研究实习员，研究方向为食药用菌研究。
通信作者：祝长杰（1969—），女，学士，研究员，研究方向为食药用菌研究。E-mail：46348676@qq
草菌的第1代至第6代菌株。丰富培养基继代培育相同。
1.3.5样品的制备
柞蚕蛹虫草60C烘干至恒重，粉碎，100目过筛，取0.5g柞蚕蛹虫草粉加水定容至100 mL，超声水提3h,5000r/min离心取上清,
0.45^m水系滤膜过滤用于液相谱测定。
1.3.6虫草素含量测定
精密称取虫草素标准品，配制成浓度范围为0.255〜50M g/mL的标准品溶液，每浓度进样10#L,3次。HPLC检测条件：Welch Ultimate XB-C18谱柱(5#m,4.6mm X 250mm)；流动相为水：乙月青=90:10(V/V)；柱温30C；流速1mL/min；进样量10M L；检测波长260nm。
记录不同浓度虫草素标准品溶液吸收峰面积并取平均值，以虫草素品浓度为
以其不同浓度所对应的吸收峰面积为纵坐标。
绘制虫草素曲线。图1为虫草素液(20ug/mL)液相谱图，图2为虫草素标准曲线，线性方程为Y=0.6693X+0.5083,R2= 0.9999。
图1虫草素标准溶液(20ug/mL)液相谱图2结果与分析
2.1蛹虫草菌冷冻保藏不同时间对其生产能力的影响
蛹虫草菌在冷冻保藏不同时间时注蛹后其柞蚕蛹虫草的数量见图3，随着冷冻保藏时间的延长，蛹虫草菌均出现出草率降彳的情况。以菌株B为例，初始时菌株B出草率为82.3%，冷冻保藏6月激活后出草率为80.7%，较初始时出草率降低1.9%；12月激活后出草率为74.3%，较初始时出草率降低9.7%；冷冻保藏18月激活后出草率为69.7%，较初始时出草率降低15.3%。可见，随着冷冻时间的延长蛹虫草菌仍然具有生产能力，生产力，生产柞蚕蛹虫草
目的生产中，蛹虫草菌合过长时间冷。
图3蛹虫草菌其
产的影响
2.2蛹虫草菌冷藏保藏不同时间对其生产能力的
蛹虫草菌在时间时蛹柞蚕蛹虫草的数见图4，时间的长，蛹虫草菌出现出草率的情况。以菌株B为例，初始时菌株B出草率为82.3%；6月后出草率为78.3%，较
时出草率49%；12月出草率为70.3%，较初始时出草率14.6%；
18月后出草率为64%，较时出草率222%。见，时间的长蛹虫草菌注蛹后出草率逐渐，故以生产柞蚕蛹虫草目的生产，蛹虫草菌合长时间
。
图4蛹虫草菌其
产的影响出草率为72.3%，较第1代下降16.6%；第5蛹虫草菌出草率687%，较1
20.8%；第6代出草率为63.7%，较第1'降26.5%。可见，丰富基中蛹虫草菌詔弋次数的增加其生产力出现的现象，
在柞蚕蛹虫草的生产蛹虫草菌在丰富基次数过多。
90
80
2.3蛹虫草菌冷藏保藏不同时间其虫草素含
化
蛹虫草菌在冷藏保藏不同时间注蛹后柞蚕蛹虫草虫草素含见图5，蛹虫草菌时间的延长，柞蚕蛹虫草出现虫草素含
的现象。菌D，时虫草素含 1.07mg/g,6月后虫草素含101mg/g，较时含56%；
12月后虫草素含0.93mg/g，较初时含131%；18月虫草素含087mg/g，较时含187%。见，蛹虫草菌时间的延长柞蚕蛹虫草中虫草素含量逐渐。
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淞6蛹虫草菌在丰富传代次数时
其产的变化
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□初始□第&月因第12月圈第1呂月
图5蛹虫草菌冷藏保藏不同时间其虫草素含量变化2.5蛹虫草菌在PDA基次数时其生产能力的变化
在PDA培养基中，蛹虫草菌在不同传代次数时出草率见图7，蛹虫草菌在PDA基中育其出草率。以菌株A为，第1代蛹虫草菌出草率为86%；第2代蛹虫草菌出草率为83.7%，较第1 2.7%；
3代出草率为78.7%，较第18.5%；
4代蛹虫草菌出草率为73.3%，较第1:
蚕蛹虫草
14.8%；第5代蛹虫草菌出草率为68.7%，较第120.1%；第6代出草率为65%，较第124.4%。可见，在PDA基蛹虫草菌次数的增加其生产能力均出现的现象，与在丰富基I同。
2.4蛹虫草菌在丰富培养基中不同传代次数时其生产力的化
蛹虫草菌在丰富基次数时生产能力见图6。以菌株A，第1代蛹虫草菌出草率867%；2蛹虫草菌出草率81%，较第1 6.6%；第3代出草率为76.7%，较第111.5%；第4代蛹虫草菌
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7
图蛹虫草菌在PDA传代次数时
其生产能力的变化
3讨论
在柞蚕蛹虫草的生产中，蛹虫草菌的保藏时间、保藏方法、传代次数等都对柞蚕蛹虫草生产的影响巨大。
菌种保藏过程中，随着保藏时间的延长蛹虫草菌均会出现生产能力降低的现象，但冷冻保藏较冷藏保藏蛹虫草菌生产能力降低的速度慢，故冷冻更适合用来保藏蛹虫草菌，但在柞蚕蛹虫草的批量生产中还应尽量减少蛹虫草菌的保藏时间以达到良好的生产效果。
随着冷藏保藏时间的延长虫草素含量逐渐降低，故在以高产虫草素为目的的柞蚕蛹虫草的批量生产中，应尽量减少蛹虫草菌的保藏时间。
PDA培养基中虫草菌生产能力下降的速度在不同传代次数时均慢于在丰富培养基中，可见PDA培养基更适合蛹虫草菌的继代保藏，在柞蚕蛹虫草的生产应PDA 培养基作为蛹虫草菌的保藏培养基，同时尽量生产用蛹虫草菌的次数，到产柞蚕蛹虫草的目的。
参考文献
[]范国宇，孙晶波，杜培革.北冬虫夏草改善肿瘤患者睡眠问题[J].中国老年学杂志，2018,38(16)：
3869-3870
[]胡学生，张美双，田淋淋，等.北虫草的化学成分
及药理作用[J].吉林中医药，2016,36(3)：281-
283
[3]刘城移，李琳，郝心怡，等.蛹虫草MF27菌糠多
糖对肝细胞氧化损伤的保护作用[J].菌物学报,
2020，39(2)：409-420
[4]Yanyan Lao,Min Zhang,Zhongqin Li,Bhesh
Bhandari.A novel combination of enzymatic hy
drolysis and fermentation：Effects on the flavor
and nutritionalquality offermented Cordyceps
militaris beverage[J].LWT,2020,120.
[5]Xiao Long,Sun Shuang,Li Kejuan,Lei Zhong-
fang,Shimizu Kazuya,Zhang Zhenya,Adachi
Yasuhisa.Effects of nanobubble water supple-
mentationonbiomassaccumulationduringmyce-
lium cultivation of Cordyceps militaris and the
antioxidantactivitiesofextractedpolysaccharides
[J]BioresourceTechnologyReports，2020，12 [6]Jian Dong Cui Biotechnologicalproductionand
applicationsofCordycepsmilitaris，avaluedtra-
ditionalChinesemedicine[J]CriticalReviewsin
Biotechnology，2014，35(4)
[7]赵星月，李倩，刘文静，等.蛹虫草菌生物合成虫
草素的研究进展[J].生物工程学报,2020,36(7):
1293-1304
[]朱丽娜，刘艳芳，张红霞，等.不同来源的蛹虫草子实体活性成分的比较[J].菌物学报，2018,37
(12)：1695-1706
[9]郑庆伟.研究表明：白僵菌、绿僵菌和蛹虫草等虫
生真菌合成新药分子潜力巨大[J]•农药市场信
息,2020(13):47.
Effects of Storage Methods on Production Capacity of Cordyceps militaris
LIU Juan,ZHANGJunhui,WANG Qin,ZHOU Ying,QIAN Kun,ZHU Changjie* (Jilin Sericultural Scientific Research Institute,Jilin Jilin132012,China)
Abstract：The preservation method of C.militaris has a great influence on the yield and the content of active substances of C.militaris/and the production capacity of C.militaris is gradually weakened wi
ththeextensionofthefreezingpreservationtime Theproductioncapacityandcordycepincontent of C.militaris after pupa injection decrease with the extension of the refrigerated storage time.In both rich medium and PDA medium,the production capacity of C.militaris decreases with the increase of times of successive culture,but the rate of decrease is slower in PDA medium,indicating thatPDA mediumismoresuitableforthepreservationof C．militaris
Keywords C．militaris；strainpreservation；productioncapacity
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