茶 叶 科 学 2009，29（5）：341~346 Journal of Tea Science
收稿日期：2009-04-08 修订日期：2009-06-09
作者简介：王丽鸳（1978— ），女，浙江金华人，助理研究员，主要从事茶树遗传育种和茶叶生物工程研究。*通讯作者：E-mail ： icaas
王丽鸳1，刘本英1，姜燕华1，段云裳2，成浩
1*
，周健1，唐一春3
（1. 中国农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008；
2. 南京农业大学，江苏 南京 210095；
3. 云南农业科学院茶叶研究所，云南 勐海 666201) 摘要：本研究利用50对来自茶系的SSR 引物对41份茶组资源进行PCR 扩增，研究不同类型SSR 引物的通用性和多样性指数。研究结果表明，茶系的SSR 引物在茶组植物中的通用性高，其中EST-SSR 通用性多态位点的比例达到60%。另外，利用SSR 标记技术对茶组材料的遗传多样性进行分析。不同位点在种间的等位基因数为2~6个，平均每个位点4.21个等位基因。通过UPGMA 方法构建了茶组12个种的遗传进化关系图。 关键词：茶组；遗传进化分析；SSR ；通用性 中图分类号：S571.1；Q311 文献标识码：A 文章编号：1000-369X （2009）05-341-06
Phylogenetic Analysis of Interspecies in Section
Thea Through SSR Markers
WANG Li-yuan 1, LIU Ben-ying 1, JIANG Yan-hua 1, DUAN Yun-shang 2,
CHENG Hao 1*, ZHOU Jian 1, TANG Yi-chun 3
(1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences; National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China;
2. Nanjing Agricultural University; Nanjing 210095, China;
3.Tea Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Menghai 666201, China)
Abstract : For the purpose of investigating the transferability and polymorphism information content (PIC) of different types of SSR primers, PCR amplification for 41 accessions from section thea was conducted in this investigation. The results showed that the SSR primers form Ser. Sinensis were highly transferable among section Thea . The polymorphic and transferable primers account for 60% of EST-SSR markers. Then the genetic diversity among 12 species of section Thea was evaluated through SSR analysis. The number of alleles in different loci ranged from 2 to 6, with average 4.21 per locus. The phyolgenetic dendrogram was constructed by the UPGMA. Keywords : section Thea , phylogenetic analysis, SSR marker, transferability
茶组Sect. Thea (L.)Dyer 属于山茶属(Camellia )，除茶C. sinensis 为广布种外，其它茶组植物几乎全产于中国南部与西南部，仅少数扩展到缅甸与越南[1,2]。茶组包含世界三大饮料之一的茶叶（茶C. sinensis 、普洱茶C. sinensis var. assamica 等），是山茶属中最重要
的一个组，具有重要的经济、社会和生态价值，一直为农学、园艺学、分类学家所关注。该组在形态上表现出较大的变异，张宏达将茶组分为42种4变种[1~3]，而闵天禄将该组合并为12种6变种[4]。因此利用最新的分子标记技术对该组植物进行系统学研究，为该组物种的科
茶叶科学29卷342
学分类提供新的佐证是必要的。上世纪90年代，随着分子系统学的兴起和发展，分子生物学的研究手段开始被引入茶树遗传多样性[5]及分子系统学[6]研究中。
微卫星（microsatellite），也称简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），是一类由2~6个核苷酸为重复单元组成的简单重复序列。微卫星首先在人类遗传的研究中被发现。1996年，Powell等对SSR的优点做了很好的综述，如共显性、多态性相对丰富、基因组覆盖较多等[7]。由于该技术具有简便、快速、稳定性高和等位基因多样性高等特点，在基因组研究中作为一种主要的分子标记技术，已经广泛地应用于遗传图谱的构建、遗传多样性分析和系统学研究[8~10]。已经证明，SSR引物不仅在同一属内的不同种间能扩增重复序列，而且在同一科不同属的物种间甚至是不同科之间也能扩增出重复序列[11~13]。本文利用来源于茶（C. sinensis）的SSR引物共50对，分析了茶组10个种2个变种共41个材料的SSR 引物通用性、遗传多样性及遗传关系，并对茶组植物的分类进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 供试样品
实验材料来自国家茶树种质资源圃勐海分圃的41份茶树种质资源，按张宏达系统分类，包含茶组植物的10个种和2个变种（表1）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取
按照刘本英等[14]的方法。
1.2.2 SSR引物
根据文献共合成50对SSR引物，其中基因组SSR引物6对[15]，叶绿体SSR引物4对[16]，EST-SSR引物30对[17,18]，自行设计的EST-SSR引物10对。
1.2.3 SSR扩增
反应体系为：DNA模板10~40 ng，ddH2O 6.60 µL，10×Buffer 1.0 µL，Mg2+(25 mmol/L) 0.7 µL，dNTP(10 mmol/L)0.2 µL，primers(10 µmol/L)各0.2 µL，Taq酶0.5 U。扩增程序为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，在最适温
度下退火30 s，72℃延伸50 s，共35个循环，最后72℃再延伸10 min，4℃保温。扩增产物
用10%的聚丙烯酰胺凝胶检测，电泳在JY-SCZ7型电泳仪(北京君意东方电泳设备有
限公司，中国北京)上进行，时间为120 min，电压设定为170 V，电泳后参照文献[19]的方
法银染显。Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像
仪(Bio-Rad Laboratories)拍照记录。
1.2.4 数据处理与分析
SSR是共显性标记，同其它DNA 指纹分
析的结果一样为二元性状，属于同一位点的
产物按扩增阳性（有条带）为1，扩增阴性（无
条带）为0记录电泳图谱，形成SSR表型原
始数据阵。以Powrmarker软件[20]在假定哈丁
-温伯格平衡条件下计算平均遗传相似系数、
基因多态性[21]和多样性指数（Polymorphism information content, PIC）[22]，并采用UPGMA (Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean) 聚类分析方法构建分子系
统状。
2 结果与分析
2.1 SSR引物在茶组植物中的通用性及基因多样性
本研究共采用了50对来自茶或阿萨姆茶
的SSR引物对41份茶组资源进行PCR扩增，不同类型SSR引物的通用性和多样性指数（PIC）见表2。研究结果表明，EST-SSR引
物的具有多态性的通用引物比率最高为60%，平均PIC值为0.4910；而叶绿体SSR引物的
多态性通用引物的比率为50%，但是平均PIC
值很低为0.2333。
2.2 茶组相关种间遗传多样性和遗传距离分析
根据28对茶组中具多态性的通用SSR引
物在41份茶树资源PCR扩增的结果，对茶组
植物的种间遗传多样性和遗传距离进行分析。
5期王丽鸳，等：用SSR分子标记研究茶组植物种间亲缘进化关系343
实验结果28个通用位点共产生118个等位基因。不同位点在种间的等位基因数目不同，等位基因数为2~6个，平均每个位点4.21个；28个通用位点共产生210种基因型，平均每个位点7.50种基因型。种间或变种间的遗传距离分析表明（表4），茶系的茶C. sinensis 和五室茶系的大厂茶C. tachangensis的相似系数最低为0.5310，而同为五柱茶系的老黑茶C. atrothea与大理茶C. taliensis的相似系数最高为0.7366。
表1 研究植物材料
Table 1 Tested plant Materials
种或变种Species/Varieties 种质名称Accession name 种质类型 Germplasm type 来源Origin 高树茶C.arborescens牛寨大茶树野生资源云南盐津
马安大茶野生资源云南威信
阿萨姆茶C.assamica勐拉红梗白芽引进品种缅甸
香竹箐大叶地方品种云南凤庆
雅口大叶茶地方品种云南澜沧
文山小街茶地方品种云南文山
西舍路白芽茶地方品种云南楚雄
老黑茶C.atrothea元江野茶野生资源云南元江
达诺茶野生资源云南楚雄
兔街茶野生资源云南南华
厚轴茶C.crassicolumna鲁大村大茶树野生资源云南楚雄
磨房茶野生资源云南元江
大坝大树茶野生资源云南麻栗坡
金厂大树茶野生资源云南麻栗坡假秃房茶C.gymnogynoides 牛寨老林茶野生资源云南盐津
青龙大树茶野生资源云南大关
昌选1号品系云南昌宁
滇缅茶C.irrawadiensis梁河勐养丛茶地方品种云南梁河
河头荒野茶野生资源云南龙陵
黄泥河野茶野生资源云南富源
右甸宝红茶野生资源云南昌宁
龙山大山茶野生资源云南龙陵
广南茶C.kwangnanica珠街茶地方品种云南广南
高良野茶野生资源云南师宗
大厂茶C.tachangensis箐口大树茶野生资源云南师宗
岔河大茶野生资源云南富源
白毛茶C. var publimba乐昌白毛茶育成品种广东
勐宋大叶茶地方品种云南勐海
龙脊茶品系广西
茶C.sinensis片古岗茶地方品种云南泸水
易门茶地方品种云南易门
广东大叶茶地方品种广东
古林箐茶地方品种云南马关
桐庐茶地方品种云南宣威
大理茶C.taliensis星源本山茶野生资源云南凤庆
水泄大树茶野生资源云南永平
弄岛野茶1号野生资源云南瑞丽
忙丙大山茶2号野生资源云南镇康
漭水宝红茶野生资源云南昌宁
元江茶C.yankiangcha者竜峨毛茶珍稀品种云南新平
兔街白芽口茶地方品种云南南华
茶 叶 科 学 29卷
344
表2 茶组植物SSR 位点的通用性及基因多样性
Table 2 Transferability and gene diversity of SSR locus in Section Thea
SSR 引物类型 Types of SSR primers 检测SSR 位点数 Number of SSR lotus
通用位点数 Number of transferable locus
多态位点数
Number of polymorphism locus
多态位点百分例 Polymorphism percentage
平均PIC 值 Average value of PIC
基因组SSR 6 3 2 33% 0.6297 叶绿体SSR
4 2 2
50% 0.2333 EST-SSR 40
24
24
60%
0.4910
2.3 茶组（section Thea ）12个种的聚类分析
根据茶组植物种间的遗传距离矩阵，通过UPGMA 方法分析12个种间的亲缘关系。从SSR 聚类的结果来看（图1），将12个种分为2组，第一组由五室茶系Ser . Quinquelocularis 的广南茶 C. kwangnanica 和大厂茶C . tachangensis 组成；而另外10个种的茶组植物，虽然分属五柱茶系（Ser. Pentastylae ）、秃房茶系（Ser. Gymnogynae ）和茶系（Ser. Sinensises ）3个系，被分为第二组。聚类分析显示，同属五柱茶系Ser. Pentastylae 的大理茶C. taliensis 和滇缅茶C. irrawadiensis 、老黑茶C. atrothea 与秃房茶系Ser. Gymnogynae 的秃房茶C . gymnogynoides 关系比较近；特别是茶系（Ser . Sinensises ）的茶种C . sinensis 、阿萨姆茶C . assamica 和白毛茶C . var publimba 亲缘关系比较近，被聚在一起。
3 讨论
大麦[11]、葡萄[12]、大豆[13]等研究表明SSR 引物在不同的物种间具有一定的通用性，即可转移性。本研究表明，来源与茶的SSR 引物，在整个茶组植物中具有较高的通用性，其中基因组SSR 引物和EST-SSR 引物的通用性和多样性指数都比较高，叶绿体SSR 引物的通用性也不错，但是平均PIC 值只有0.2333，多样性程度明显低与基因组SSR 和EST-SSR 引物。本研究表明，茶系的SSR 引物在茶组植物中的通用性高，完全可以用来源与茶系的SSR 引物来开发茶组植物通用SSR 引物，用于茶组植物的系统分类、演化等研究，尤其用EST-SSR 引物开发时，多态性通用SSR 引物的比例可以达到60%，平均PIC 值为0.4910。本研究使用的10%聚丙烯酰胺凝聚电泳方法
图1 根据SSR 数据分析构建的茶组植物12个种的分子进化树
Fig. 1 The UPGMA dendrogram of 12 species from section Thea based on SSR data
C. kwangnanica C. tachangensis C. arborescens C. crassicolumna C. yankiangcha C. gymnogynoides C. atrothea C. irrawadiensis C. taliensis C. sinensis C. assamica C. var. publimba
5期王丽鸳，等：用SSR分子标记研究茶组植物种间亲缘进化关系345
对SSR位点的多态性进行检测，分辨率较低。如果用分辨率达到 1 bp的测序电泳进行检测，可能可以提高SSR引物的通用性及PIC 值。
茶组在形态上表现出较大的变异，张宏达将茶组分为42种4变种[1~3]，而闵天禄将该组合并为12种6变种[4]。本研究运用SSR分子标记技术对该组植物进行研究，为该物种的科学分类提供新的佐证。总的来说，本研究的分析结果基本上支持张宏达的茶组植物分类方法，说明形态上的相似性与DNA的相似性有很强的相关性。但在具体物种间的遗传关系上却不尽相同，如五柱茶系的老黑茶 C. atrothea与秃房茶系Ser. Gymnogynae的秃房茶C. gymnogynoides亲缘关系较近，与传统分类研究结果有所出入，原因可能在于基因型分析反映的相似性高并不完全代表亲缘关系远近，尚需其他分析加以进一步研究。
表3 茶组SSR位点和基因多样性
Table 3 Gene diversity of SSR locus and alleli in Section Thea
进化标记
位点Locus 基因型数
Genotype number
等位基因数
Allele number
基因多样性
Gene diversity
杂合率
Heterozygosity
多样性指数
PIC
FE942905 4 4 0.5262 0.7317 0.4677
FE861172 9 4 0.6428 0.2250 0.5893
CV014473 5 4 0.4816 0.6341 0.4195
CV014525 8 5 0.3288 0.2250 0.3140
CV014172 12 5 0.7207 0.6585 0.6721
CV699835 13 6 0.7264 0.4878 0.6797
CV014581 4 3 0.2059 0.0250 0.1958
CV013805 7 4 0.5494 0.5366 0.4739
CV013686 12 5 0.7202 0.7179 0.6717
CV014783 4 3 0.4488 0.0244 0.3828
CV013826 4 3 0.2213 0.0976 0.2093
CV014903 7 4 0.5851 0.4390 0.5246
CV014285 7 4 0.6365 0.7317 0.5642
CV013666 8 5 0.5725 0.4000 0.5010
DN976198 2 2 0.0241 0.0244 0.0238
DN976175 6 4 0.4429 0.3902 0.4017
AJ621790 12 6 0.7240 0.6829 0.6777
AJ621798 11 5 0.6472 0.3415 0.6016 ccmp2 3 3 0.4405 0.6341 0.3536 ccmp6 4 3 0.1163 0.0732 0.1129 CV067063 8 5 0.6084 0.2368 0.5541
CV014636 8 4 0.6231 0.2927 0.5746
CV014452 11 5 0.6660 0.4878 0.6131
CV014421 9 5 0.6023 0.4146 0.5548
CV014397 8 4 0.6719 0.5500 0.6108
CV011305 7 4 0.6136 0.4878 0.5479
CV011305 8 4 0.6137 0.4615 0.5602
CV013680 9 5 0.7330 0.2973 0.6851 Mean 7.5 4.21 0.5319 0.4039 0.4835
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茶叶科学29卷346
表4 根据SSR分析结果的茶组12个种的相似系数（上）和遗传距离（下） Table 4 Genetic similarity (up) and genetic distance (down) of 12 species or varieties based on SSR analysis
种 Species or varieties C.arb C.assam C. C.irr C.kwang C.sin C.tach C.tali C.var.pub C.yank C. arborescens 1.00000.5893 0.6518 0.63240.66670.66880.6250 0.64700.5804 0.6607 0.6280 0.5893 C. assamica0.4107 1.0000 0.6875 0.66820.71580.70180.6259 0.70680.6009 0.7295 0.7125 0.6902 C. atrothea0.34820.3125 1.0000 0.66960.70540.72140.6220 0.69880.6131 0.7366 0.7113 0.6815 C. crassicolumna0.36760.3318 0.3304 1.00000.66960.67800.6190 0.61850.6324 0.6860 0.6429 0.6146 C. gymnogynoides0.33330.2842 0.2946 0.3304 1.00000.73900.5595 0.69290.5685 0.7068 0.6339 0.6756 C. irrawadiensis0.33130.2982 0.2786 0.32200.2610 1.00000.5804 0.67800.5893 0.7393 0.6458 0.6875 C. kwangnanica0.37500.3741 0.3780 0.38100.44050.4196 1.0000 0.58450.6518 0.6205 0.5982 0.6518 C. sinensis0.35300.2932 0.3012 0.38150.30710.32200.4155 1.00000.5310 0.6619 0.6857 0.6568 C. tachangensis0.41960.
3991 0.3869 0.36760.43150.41070.3482 0.4690 1.0000 0.6384 0.5744 0.5982 C. taliensis0.33930.2705 0.2634 0.31400.29320.26070.3795 0.33810.3616 1.0000 0.7098 0.6607 C. var.publimba0.37200.2875 0.2887 0.35710.36610.35420.4018 0.31430.4256 0.2902 1.0000 0.6280 C. yankiangcha0.41070.3098 0.3185 0.38540.32440.31250.3482 0.34320.4018 0.3393 0.3720 1.0000
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