王海棠;于盱;刘艳;梁呈元;李维林
【摘 要】The author reviewed the research advance in the molecular biology of plants in Menthe genus, including enzymatic genes related to volatile oil synthesis way, limonene synthase gene, molecular evolution and so on.%从薄荷属植物挥发油合成途径相关酶基因、柠檬烯合酶基因和分子进化等方面对薄荷属植物的分子生物学研究进行了综述. 【期刊名称】《江西农业学报》
【年(卷),期】2012(024)012
【总页数】5页(P59-63)
【关键词】薄荷;柠檬烯合酶基因;基因克隆;分子进化
【作 者】王海棠;于盱;刘艳;梁呈元;李维林
【作者单位】江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京210014;江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京210014;江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京210014;江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京210014;江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京210014
【正文语种】中 文
【中图分类】S567.235
薄荷油在医药、食品、香料和化工等行业中都具有广泛的应用。单萜是由2个异戊二烯结构单元组成的C10类萜类化合物及其衍生物。单萜作为薄荷油的主要成分，其合成途径以及调控机制一直受到研究者的关注。经过多年的研究，不仅明确了薄荷油合成途径中的各个反应步骤，而且其相关酶基因的研究也取得了较大的进展。本文对薄荷属植物挥发油合成途径相关酶基因的发现和克隆、薄荷油合成途径中关键限速酶柠檬烯合酶基因的克隆与遗传转化，以及薄荷属植物的分子进化研究等方面的最新研究进展进行了全面综述，以期对薄荷挥发油合成途径相关酶基因的更深入研究、改造和应用提供参考。
1 薄荷属植物挥发油合成途径相关酶基因研究进展
单萜是薄荷挥发油主要成分。单萜是由2个异戊二烯结构单元组成的C10类萜类化合物及其衍生物。单萜类化合物在抵抗微生物病原菌、防御昆虫和植食性动物方面有着重要的作用，在吸引昆虫传粉和植物种竞争中也很重要［1］。薄荷挥发油合成途径被视为是植物单萜合成途径的典型模式［2］。挥发油最主要的成分薄荷脑的形成需要经过很多步骤的反应，包括一系列不同类型的生化反应［3-5］。同时，催化每个反应的酶也都已经被阐明［4-11］。
图1为薄荷单萜合成路径，描述了从萜类生物合成共同前体IPP或DMAPP生成单萜合成唯一前体GPP开始，到最终生成薄荷油主要成分薄荷油和薄荷酮的全部反应步骤［12］。相关的酶有:(1)香叶基焦磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase)，(2)柠檬烯合酶［(-)-limonene synthase］，(3)细胞素P450-柠檬烯-3-羟化酶［cytochrome P450(-)-limonene-3-hydroxylase］，(4)反式-异薄荷烯醇脱氢酶［(-)-trans-isopiperitenol dehydrogenase］，(5)异薄荷二烯酮还原酶［(-)-isopiperitenone reductase］，(6)顺式-胡薄荷酮异构酶［(+)-cis-isopulegone isomerase］，(7)胡薄荷酮还原酶［(+)-pulegone reductase］，(8)薄荷酮还原酶［(-)-menthone reductase］，(9)细胞素P450(+)-薄荷呋喃合酶［cytochrome P450(+)-MFS］。主要的产物或者中间物:异戊烯基焦磷酸(IPP，isop
entenyl diphosphate)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP，dimethylallyl diphosphate)、香叶基焦磷酸(GPP，geranyl diphosphate)、柠檬烯(limonene)、(-)-反式-异薄荷烯醇［(-)-trans-isopiperitenol］、(-)异薄荷二烯酮［(-)-isopiperitenone］、(+)-顺式-异胡薄荷酮［(+)-cis-isopulegone］、胡薄荷酮［(+)-pulegone］、(+)-薄荷呋喃［(+)-menthofuran］、(-)- 薄荷酮［(-)-menthone］、(-)-薄荷醇［(-)-menthol］、(+)- 新薄荷醇［(+)-neomenthol］。
尽管薄荷油合成的各个反应步骤都已经很明确，但是对于其潜在的调控机理还不是很清楚。萜类合成途径主要受其基因型调控，此外植物细胞环境和生长时期也有一定的影响。单萜是在腺体细胞这个特定场所合成的，而且只有盾状细胞才能分泌［13］。为了得到薄荷油合成途径相关基因的信息，Lange等［14］通过对薄荷油腺分泌细胞cDNA文库测序，获得了1316个随机测序的克隆或EST。对这些序列进行了初步的功能分析和分类，结果显示，编码生物合成代谢途径相关酶的EST序列达到全部序列的48%。这为后续的薄荷油生物合成相关酶基因的克隆及功能研究等工作提供了重要的序列信息。目前已经获得的薄荷萜类生物合成相关基因见表 1［15-40］。
图1 薄荷单萜合成路径
2 柠檬烯合酶研究进展
柠檬烯是最简单的环形单萜，广泛存在于植物挥发油中，如薄荷属、柑橘属、松科、伞形科等植物［29］。在薄荷中，柠檬烯是薄荷挥发油合成的前提，在薄荷酮化学型薄荷或香芹酮化学型薄荷的合成中，柠檬烯合酶催化GPP环化为柠檬烯［3］，该反应决定薄荷油合成途径的整体反应速率［30］。柠檬烯合酶是最典型的被子植物单萜环化酶，该酶大小为65 kDa，pI值大约为5，最佳反应pH值为7左右。柠檬烯合酶需要与二价金属离子(如Mg2+或Mn2+)才能与底物结合并催化反应。此酶可以识别香叶基并作为它的底物，还对半胱氨酸残基、甲硫氨酸残基、组氨基酸残基等较为敏感。
基因的遗传转化及在体外表达是很理想的研究基因功能的手段。为了更深入地了解柠檬烯合酶的调控机理，Colby等［11］根据从留兰香挥发油腺体获得的柠檬烯合酶氨基酸序列，设计核苷酸引物，并利用该引物从留兰香叶片cDNA文库中锚定了4个柠檬烯合酶基因相关克隆。这是首次获得柠檬烯合酶基因的序列，并将所获得的3个全长片段转化E.coli，成功获得了可以被柠檬烯合酶多克隆抗体识别的多肽，同时该多肽催化GPP后可以生成与植物体内柠檬烯合酶催化反应相同的产物。Krasnyanski等［31］利用农杆菌介导法和原生质体
直接转化方法将构建好的4S-LS过量表达载体分别转化椒样薄荷，对转基因薄荷挥发油组分进行分析时发现，薄荷酮、薄荷呋喃、胡薄荷酮等成分含量较野生型有所增加，而薄荷醇含量有所降低，而柠檬烯含量只有微小的变化。Diemer等［32］将留兰香来源的4S-LS基因转化分别转化M.piperita和M.arvensis，并对其转基因植株的挥发油成分进行了测定，在转基因M.piperita植株中，总单萜含量较对照有所增加;但在转基因M.arvensis植株中却得到了相反的结果，这可能是由于转化的基因序列与其受体内的序列同源性不够一致，导致该片段抑制了原来体内基因的表达。
表1 已经获得的薄荷萜类生物合成相关基因基因 功能 登录号 植物 参考文献DXP synthase 转酮醇酶 AF019383 M.piperita Lange［16］DXR 还原异构酶 AF116825 M.piperita Lange等［17］Isopentenylphosphate kinase 激酶 AF179283 M.piperita Lange等［18］GPP synthase 异戊烯转移酶 AF182827、AF182828 M.piperita Burke等［19］4-S Limonene synthase 单萜合酶 L13459 M.spicata Colby等［11］No data M.piperita Lange 等［14］175323 M.longifolia Crock 等［20］Linalool synthase 单萜合酶 AY083653 M.citrata Crowell等［40］β-Farnesene synthase 倍半萜烯合酶 AF024615 M.piperita Crock等［20］Muroladiene synthase 倍半萜烯合酶 AJ786641 M.piperita Prosser等［21］Limon
ene-3-hydroxylase 羟化酶 AF124816 M.piperita Lupien等［22］AY622319 M.spicata L.‘Crispa’ Lücker等［23］acilis Bertea 等［24］Limonene-6-hydroxylase 羟化酶 AF124815 M.spicata Lupien等［22］acilis Bertea 等［24］Menthofuran synthase 胡薄荷酮羟化酶 AW255974 M.piperita Bertea等［25］Pulegone reductase 还原酶 AY300163 M.piperita Ringer等［26］Isopiperitenone reductase 还原酶 AY300162 Menthone reductases 还原酶 AY288137、AY288138 M.piperita Davis等［28］Isopiperitenol(-)-carveol dehydrogenase脱氢酶 AY641428 M.piperita Ringer等［27］
3 薄荷属分子进化研究进展
对于薄荷属的起源与进化，已经运用形态学、植物解剖学、植物孢粉学、植物化学进行了研究，随着分子生物学的发展，特别是PCR技术的应用，分子进化已经成为研究薄荷属植物进化的重要手段。Khanuja等［33］利用RAPD对印度主要薄荷品种进行了遗传关系分析，并根据聚类结果，推测Mentha gracilis Sole cv.cardiaca可能是M.arvensis L.和M.spicata L.的杂交后代。另外一项RAPD研究证实，与椒样薄荷(M.piperita)相比，留兰香(
进化标记M.spicata L.)与M.gracilis之间的亲缘关系更近。同时发现，美国不同地区栽培的薄荷品种之间遗传多样性很小［34］。Gobert等［35］利用AFLP 对62 份不同种不同种植地区的薄荷材料进行了分类研究，聚类分析结果明显分成2个大的聚类，其中一个体包括M.suaveolens、M.spicata I、M.spicata II和M.longifolia;另一个体包括M.arvensis、M.aquatica和M.piperita。研究结果大体上可以对5个种的薄荷植物进行分类(留兰香包括2个组，其他4个种各自成为一个组)，但是个别几个材料在不同聚类分析中的位置变化较大，对其遗传关系还有待考证。Shasany等［36］利用AFLP标记对7个薄荷种之间的亲缘关系进行了研究，UPGMA方法聚类结果中M.longifolia与M.gentilis之间的相似性为84%，是所观察的7个种之间相似性最高的。Zabta等［37］利用RAPD标记对15份Mentha royleana和15份Mentha spicata进行了聚类分析，得出了分别包括2个种的所有植物材料的2个独立分支，暗示着种之间的遗传多态性很高。但是这类分子标记的重复性不够稳定，而且对PCR扩增条件敏感，不同的实验环境很难得到完全相同的多态位点。随着其他物种中系统发育研究的深入，更好的分子进化标记基因信息的开发也给薄荷属植物系统进化研究带来了新的研究思路。Attiya等［38］成功扩增出叶绿体基因rps11和rps14，使用12种限制性内切酶进行酶切，对PAGE凝胶电泳获得的带型进行多态分析。通过这样的方法，他们发
现M.spicata与其他6种薄荷属植物有很多的差异。但是，将薄荷体与烟草进行比较的时候发现，薄荷属植物可以很好地聚类到一起，证明了这些薄荷属植物起源于一个共同祖先。Chen等［39］结合一些形态特征和叶绿体非编码DNA序列对薄荷6个种和2个杂合体的遗传关系进行了分析，成功地将2个不同化学型的薄荷类加以区分。
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