Tm值就是DNA熔解温度,指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA,Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。 退火温度
(Annealing Temperature) 为引物和模板结合时候的温度参数,当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度·它是影响PCR
特异性的较重要因素。在理想状态
下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火, 同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。 在模板变性后温度快速冷却至40℃~60℃(某个退火温度)的时候,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞,这就使PCR后期的过程成为可能。
计算方法
核酸Tm值(解链温度)计算
评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度,
当核酸达到Tm值时,其260nm吸收量可增加百分之四十(紫外吸收量随解体程度而增加,直至完全解体。
长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中,Size = 引物长度。
2温度时间
退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个退火温度核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。
在金属加工领域,退火温度是指退火时金属应加热达到的温度。据有关文献介绍,不同金属材料的退火温度为:铂,900—1000℃;铜,650℃;黄铜,600—650℃;镍银,650—680℃;铝,283—350℃等
影响Tm值的因素:
①DNA碱基组成:C-G含量越多,Tm值越高;A-T含量越多,Tm值越低。
②溶液的离子强度:在低离子强度中,Tm较低,而且解链的温度范围较宽;在高离子强度中,Tm值较高,解链的温度范围较窄。
③PH值:溶液的PH值在5~9范围内,Tm值变化不明显,当PH>11或PH<4时,Tm值变化明显。
④变性剂:各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值。
⑤DNA双链本身的长度。