一种COVID-19口服耐热mRNA疫苗及其制备方法与流程

一种covid-19口服耐热mrna疫苗及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种covid-19口服耐热mrna疫苗及其制备方法，属于医药技术领域。
2.

背景技术：

3.covid-19病毒是一种能够引起急性呼吸道感染的冠状病毒，新型冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。
4.covid-19病毒通过粘膜感染宿主，最可取的抵御covid-19病毒的方式是在粘膜部位诱导保护性免疫，作为抵御感染的第一道防线。但到目前为止，绝对数量优势的covid-19疫苗均为通过肌内注射途径进入人体的注射剂，因人个体免疫力差异，绝大部分人以注射方式抵御感染导致黏膜免疫力低下甚至不产生黏膜免疫，仍然被covid-19病毒反复感染，所以通过粘膜途径建立黏膜免疫并诱导全身免疫是抵御covid-19病毒感染的有效方法。除此以外，采用粘膜给药途径，从增加患者的依从性到诱导“比通过传统免疫反应途径实现”的更有效的免疫反应，与注射剂相比也具有其他优势：生产环境要求低于注射剂而变得更易于制造、在常温下稳定而便于运输和储存、无需穿刺杜绝对皮肤的损伤和局部不适。口服疫苗的理想状态是通过普通黏膜免疫系统的激活，诱导粘膜免疫，产生全身和局部的有效的免疫反应。

技术实现要素：

5.本发明中所说的covid-19口服耐热mrna疫苗是一种舌下含服的采用冻干直接赋型制备的冻干舌下片，该冻干舌下片载有包裹着免疫原的纳米粒，置于舌下遇到唾液迅速溶解释放载有免疫原的纳米颗粒，纳米颗粒与舌下黏膜细胞膜具有良好的亲和力，将免疫原递送进入细胞内部释放免疫原，免疫原被继续转运至粘膜相关淋巴组织，刺激产生抗体，建立黏膜免疫并诱导全身免疫。
6.本发明所述的制剂是一种水溶性组分组成的骨架片，包括水溶性组分组成的骨架、附着于骨架上的包裹有免疫原的纳米粒、冷冻保护剂和干燥保护剂，以及可能含有的佐剂；其特征在于：骨架支撑材料包括多个氨基酸残基组成的蛋白多肽、多羟基直链多糖和/或高分子材料和结晶性氨基酸和/或糖醇组成；包裹有免疫原的纳米粒是脂质纳米粒，由蛋黄卵磷脂、胆固醇等组成的单室或多室脂质颗粒/囊泡；冻结保护剂和干燥保护剂包括蛋白多肽、二糖、多羟基直链多糖的一种或几种；佐剂包是糖蛋白或细菌毒素，或不包含佐剂。
7.本发明所述冻干舌下片，其特征在于：溶解时间小于5秒。
8.本发明所述的包裹有免疫原的脂质纳米粒，其特征在于：免疫原为含有covid-19病毒编码抗原蛋白的mrna，通过由蛋黄卵磷脂和胆固醇组成的囊材包裹，粒径和粒度分布为50～80nm。
9.本发明所述的脂质纳米粒，其特征还在于：纳米粒通过冷冻干燥和高压均质制成—首先取含有covid-19病毒编码抗原蛋白的mrna原液、去除热源的鱼源蛋白置于常温注射用水中搅拌成溶液为水相，取蛋黄卵磷脂、胆固醇溶于无水乙醇中为有机相，将水相和有机相混合并加入吐温-80搅拌均匀，注入托盘冷冻干燥制成前体脂质体，前体脂质体溶于常温注射用水，高压均质七个循环，制成粒径和粒度分布为50～80nm的脂质纳米粒混悬液。
10.本发明所述冻干舌下片，其特征在于：骨架材料由明胶、水解明胶、水溶性多肽、右旋糖苷、普鲁兰多糖、聚乙烯醇中的一种或几种以及甘露醇和/或甘氨酸组成；冻结保护剂及干燥保护剂由海藻糖、蔗糖、明胶、水解明胶、水溶性多肽、右旋糖苷、普鲁兰多糖中的一种或几种组成。
11.本发明所述的冻干舌下片还可以包括矫味剂、ph调节剂，其特征在于：骨架材料占制剂总固形物重量的比例为10～70%，载有免疫原的脂质纳米粒占制剂总固形物重量的比例为20～60%，冻结保护剂和干燥保护剂占制剂总固形物重量的比例为10～80%，佐剂占制剂总固形物重量的比例为0～3%，矫味剂和ph调节剂占制剂总固形物终量的比例为0～5%。
12.本发明还提供了一种covid-19口服耐热mrna疫苗的制备方法，步骤如下：脂质纳米粒的制备：首先取含有covid-19病毒编码抗原蛋白的mrna原液、去除热源的鱼源蛋白置于常温注射用水中搅拌成溶液为水相，取蛋黄卵磷脂、胆固醇溶于无水乙醇中为有机相，将水相和有机相混合并加入吐温-80搅拌均匀，注入托盘冷冻干燥制成前体脂质体，冻干曲线如下表所示：表3 冻干曲线如表3所述制备的前体脂质体溶于常温注射用水，高压均质七个循环，压力分别为100bar、300bar、700bar、1100bar、1500bar、1500bar、1500bar，制成粒径和粒度分布为50～80nm的脂质纳米粒混悬液；散装药液配制：将骨架材料溶于8～80℃纯化水中，搅拌至完全溶解，加入其他辅料继续搅拌至完全溶解，将药液温度降低至室温；将上述骨架及其他辅料的溶液与制备的脂质纳米粒混悬液混合并低速搅拌制成混悬液；灌装：将散装药液灌装至已成型的冷冲压成型复合硬片泡罩中；预冻：泡罩中药液至于-50℃～-70℃环境下使药液迅速冷冻成固态，或在-10℃
～-70℃环境下连续梯度降温使药液迅速冷冻成固态；冷冻控制：载有冻结药液的泡罩置于-10～-15℃环境中8～24小时或在-20～-30℃环境中保持24～48小时后重新将温度降低至-40℃，固化的药液进行低温冰晶重排，结晶性辅料处分结晶，完成冷冻控制；冻干：冻干机设定搁板预冷模式，设定温度-20℃～-30℃，将装有已固化药液的泡罩放入冻干机中，开始进行冻干，冻干曲线如下表所示：表4 冻干曲线包装：在相对湿度5～40%环境下覆铝纸复合膜，喷墨打印生产日期和批号。
13.对于预冻工序，药液在冷冻过程中可能因冻结速率差异导致局部药液中固形物浓度发生改变，为了降低或杜绝该现象，在制备过程中选择液氮速冻或以低温硅油作为传热介质将预冻腔体内温度降低至-50℃以下，腔体内采用低送风方式进行冷量传导，使药液迅速冻结为固体；亦可设定速冻腔体内多温度梯度降温方式：不同温度梯段腔体段温度以20℃为梯度，起始腔体内温度-10℃直至最后一个腔体内温度-110℃，使药液保持过冷形成更多的晶核。上述两种预冻方式均有利于药液中固形物的分散，防止预冻过程中相分离现象的发生。
具体实施方式
14.以下实施例是为了更好的说明本发明，不用以限定本发明的保护范围。
15.实施例1：本实施例提供了covid-19口服耐热mrna疫苗及其制备方法：表5 处方组成
注：1、2 为脂质纳米粒制备过程中的溶剂，冷冻干燥后除去；3 为冻干舌下片溶剂，冻干后除去。
16.covid-19口服耐热mrna疫苗制备步骤如下：脂质纳米粒的制备：取含有0.05mg的含有covid-19病毒编码抗原蛋白的mrna原液和0.2mg去除热源的鱼源蛋白置于15mg温度不高于10℃注射用水中搅拌成溶液作水相，取8.00mg蛋黄卵磷脂和4.00mg胆固醇溶于5mg无水乙醇中为有机相并将药液冷却至10℃及以下，将水相和有机相混合并加入0.02mg吐温-80搅拌均匀，注入托盘冷冻干燥制成前体脂质体，冻干曲线如下表所示：表6 冻干曲线
如表6所述制备的前体脂质体溶于0.1ml常温注射用水，高压均质七个循环，压力分别为100bar、300bar、700bar、1100bar、1500bar、1500bar、1500bar，制成粒径和粒度分布为50～80nm的脂质纳米粒混悬液；散装药液配制：将上述表格中处方用量的水解明胶、普鲁兰多糖、甘露醇、海藻糖、水溶性薄荷香精和三氯蔗糖溶于0.12ml常温注射用水中，使用截留分子量8000的滤膜超滤去除热源，得到无热源辅料溶液；将无热源辅料溶液和脂质纳米粒混悬液混合后加常温注射用水至0.3ml并低速搅拌制成混悬液；灌装：将散装药液灌装至已成型的冷冲压成型复合硬片泡罩中，灌装体积0.3ml；预冻：泡罩中药液至于-50℃～-70℃环境下使药液迅速冷冻成固态；冷冻控制：载有冻结药液的泡罩置于-20～-30℃环境中保持24～48小时后重新将温度降低至-40℃，固化的药液进行低温冰晶重排，结晶性辅料处分结晶，完成冷冻控制；冻干：冻干机设定搁板预冷模式，设定温度-20℃～-30℃，将装有已固化药液的泡罩放入冻干机中，开始进行冻干，冻干曲线如下表所示：表7 冻干曲线包装：在相对湿度5～40%环境下覆铝纸复合膜，喷墨打印生产日期和批号。
17.实施例2：本实施例提供了1000剂次covid-19口服耐热mrna疫苗及其制备方法：
表8 处方组成注：1、2 为脂质纳米粒制备过程中的溶剂，冷冻干燥后除去；3 为冻干舌下片溶剂，冻干后除去。
18.covid-19口服耐热mrna疫苗制备步骤如下：脂质纳米粒的制备：取含有0.05g的含有covid-19病毒编码抗原蛋白的mrna原液和0.2g去除热源的鱼源蛋白置于15g不高于10℃的注射用水中搅拌成溶液作水相，取8.00g蛋黄卵磷脂和4.00g胆固醇溶于5g无水乙醇中为有机相并将药液降低至10℃及以下，将水相和有机相混合并加入0.02g吐温-80搅拌均匀，注入托盘冷冻干燥制成前体脂质体，冻干曲线如下表所示：表9 冻干曲线
如表9所述制备的前体脂质体溶于100ml常温注射用水，高压均质七个循环，压力分别为100bar、300bar、700bar、1100bar、1500bar、1500bar、1500bar，制成粒径和粒度分布为50～80nm的脂质纳米粒混悬液；散装药液配制：将上述表格中处方用量的水解明胶、普鲁兰多糖、甘露醇、海藻糖、水溶性薄荷香精和三氯蔗糖溶于120ml常温注射用水中，使用截留分子量8000的滤膜超滤去除热源，得到无热源辅料溶液；将无热源辅料溶液和脂质纳米粒混悬液混合后加常温注射用水至300ml并低速搅拌制成混悬液；灌装：将散装药液灌装至已成型的冷冲压成型复合硬片泡罩中，灌装体积0.3ml；预冻：泡罩中药液至于-50℃～-70℃环境下使药液迅速冷冻成固态；冷冻控制：载有冻结药液的泡罩置于-20～-30℃环境中保持24～48小时后重新将温度降低至-40℃，固化的药液进行低温冰晶重排，结晶性辅料处分结晶，完成冷冻控制；冻干：冻干机设定搁板预冷模式，设定温度-20℃～-30℃，将装有已固化药液的泡罩放入冻干机中，开始进行冻干，冻干曲线如下表所示：表10 冻干曲线包装：在相对湿度5～40%环境下覆铝纸复合膜，喷墨打印生产日期和批号。
19.实施例3：本实施例提供了10万剂次covid-19口服耐热mrna疫苗及其制备方法：
表11 处方组成注：1、2 为脂质纳米粒制备过程中的溶剂，冷冻干燥后除去；3 为冻干舌下片溶剂，冻干后除去。
20.covid-19口服耐热mrna疫苗制备步骤如下：脂质纳米粒的制备：取含有5.0g的含有covid-19病毒编码抗原蛋白的mrna原液和20.0g去除热源的鱼源蛋白置于1500g不高于10℃的注射用水中搅拌成溶液作水相，取800g蛋黄卵磷脂和400g胆固醇溶于500g无水乙醇中为有机相并将药液降低至10℃及以下，将水相和有机相混合并加入2.0g吐温-80搅拌均匀，注入托盘冷冻干燥制成前体脂质体，冻干曲线如下表所示：表12 冻干曲线
如表12所述制备的前体脂质体溶于10kg常温注射用水，高压均质七个循环，压力分别为100bar、300bar、700bar、1100bar、1500bar、1500bar、1500bar，制成粒径和粒度分布为50～80nm的脂质纳米粒混悬液；散装药液配制：将上述表格中处方用量的水解明胶、普鲁兰多糖、甘露醇、海藻糖、水溶性薄荷香精和三氯蔗糖溶于12kg常温注射用水中，使用截留分子量8000的滤膜超滤去除热源，得到无热源辅料溶液；将无热源辅料溶液和脂质纳米粒混悬液混合后加常温注射用水至30.6kg并低速搅拌制成混悬液；灌装：将散装药液灌装至已成型的冷冲压成型复合硬片泡罩中，灌装体积0.306g；预冻：泡罩中药液至于-50℃～-70℃环境下使药液迅速冷冻成固态；冷冻控制：载有冻结药液的泡罩置于-20～-30℃环境中保持24～48小时后重新将温度降低至-40℃，固化的药液进行低温冰晶重排，结晶性辅料处分结晶，完成冷冻控制；冻干：冻干机设定搁板预冷模式，设定温度-20℃～-30℃，将装有已固化药液的泡罩放入冻干机中，开始进行冻干，冻干曲线如下表所示：表13 冻干曲线包装：在相对湿度5～40%环境下覆铝纸复合膜，喷墨打印生产日期和批号。
21.分别取具体实施例1～具体实施例3制备的covid-19口服耐热mrna疫苗进行溶解性测试，测试结果如表14所示：
表14 溶解性测试结果片重差异测定结果：对实施例1～3进行片重差异测试，结果如下：表15 片重差异测试结果

技术特征：

1.covid-19病毒是一种能够引起急性呼吸道感染的冠状病毒，新型冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。2.重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。3.covid-19病毒通过粘膜感染宿主，最可取的抵御covid-19病毒的方式是在粘膜部位诱导保护性免疫，作为抵御感染的第一道防线。4.但到目前为止，绝对数量优势的covid-19疫苗均为通过肌内注射途径进入人体的注射剂，因人个体免疫力差异，绝大部分人以注射方式抵御感染导致黏膜免疫力低下甚至不产生黏膜免疫，仍然被covid-19病毒反复感染，所以通过粘膜途径建立黏膜免疫并诱导全身免疫是抵御covid-19病毒感染的有效方法。5.除此以外，采用粘膜给药途径，从增加患者的依从性到诱导“比通过传统免疫反应途径实现”的更有效的免疫反应，与注射剂相比也具有其他优势：生产环境要求低于注射剂而变得更易于制造、在常温下稳定而便于运输和储存、无需穿刺杜绝对皮肤的损伤和局部不适。6.口服疫苗的理想状态是通过普通黏膜免疫系统的激活，诱导粘膜免疫，产生全身和局部的有效的免疫反应。7.因此研制了一种能够有效建立粘膜免疫的covid-19口服耐热疫苗。8.如权利要求1所述的covid-19口服耐热疫苗该疫苗是一种舌下含服的采用冻干直接赋型制备的免疫原为mrna的冻干舌下片，该冻干舌下片载有包裹着免疫原的纳米粒，置于舌下遇到唾液迅速溶解释放载有免疫原的纳米颗粒，纳米颗粒与舌下黏膜细胞膜具有良好的亲和力，将免疫原递送进入细胞内部释放免疫原，免疫原被继续转运至粘膜相关淋巴组织，刺激产生抗体，建立黏膜免疫并诱导全身免疫。9.如权利要求2所述的制剂是一种水溶性组分组成的骨架片，包括水溶性组分组成的骨架、附着于骨架上的包裹有免疫原的纳米粒、冷冻保护剂和干燥保护剂，以及可能含有的佐剂；其特征在于：骨架支撑材料包括多个氨基酸残基组成的蛋白多肽、多羟基直链多糖和/或高分子材料和结晶性氨基酸和/或糖醇组成；包裹有免疫原的纳米粒是脂质纳米粒，由蛋黄卵磷脂、胆固醇等组成的单室或多室脂质颗粒/囊泡；冻结保护剂和干燥保护剂包括蛋白多肽、二糖、多羟基直链多糖的一种或几种；佐剂包是糖蛋白或细菌毒素，或不包含佐剂。10.如权利要求1～3所述冻干舌下片，其特征在于：溶解时间小于5秒。11.如权利要求1～4任一所述的包裹有免疫原的脂质纳米粒，其特征在于：免疫原为含有covid-19病毒编码抗原蛋白的mrna，通过由蛋黄卵磷脂和胆固醇组成的囊材包裹，粒径和粒度分布为50～80nm。12.如权利要求5所述的脂质纳米粒，其特征还在于：纳米粒通过冷冻干燥和高压均质制成—首先取含有covid-19病毒编码抗原蛋白的mrna原液、去除热源的鱼源蛋白置于常温注射用水中搅拌成溶液为水相，取蛋黄卵磷脂、胆固醇溶于无水乙醇中为有机相，将水相和有机相混合并加入吐温-80搅拌均匀，注入托盘冷冻干燥制成前体脂质体，冻干曲线如下表所示：表1 冻干曲线
如表1所述制备的前体脂质体溶于常温注射用水，高压均质七个循环，压力分别为100bar、300bar、700bar、1100bar、1500bar、1500bar、1500bar，制成粒径和粒度分布为50～80nm的脂质纳米粒混悬液。13.如权利要求1～5所述冻干舌下片，其特征在于：骨架材料由明胶、水解明胶、水溶性多肽、右旋糖苷、普鲁兰多糖、聚乙烯醇中的一种或几种以及甘露醇和/或甘氨酸组成；冻结保护剂及干燥保护剂由海藻糖、蔗糖、明胶、水解明胶、水溶性多肽、右旋糖苷、普鲁兰多糖中的一种或几种组成。14.如权利要求1～7所述的冻干舌下片还可以包括矫味剂、ph调节剂，其特征在于：骨架材料占制剂总固形物重量的比例为10～70%，载有免疫原的脂质纳米粒占制剂总固形物重量的比例为20～60%，冻结保护剂和干燥保护剂占制剂总固形物重量的比例为10～80%，佐剂占制剂总固形物重量的比例为0～3%，矫味剂和ph调节剂占制剂总固形物终量的比例为0～5%。15.一种权利要求1～8任一项所述的“covid-19耐热口服mrna疫苗”冻干舌下片的制备方法，步骤如下：散装药液配制：将骨架材料溶于8～80℃纯化水中，搅拌至完全溶解，加入其他辅料继续搅拌至完全溶解，将药液温度降低至室温；将上述骨架及其他辅料的溶液与权利要求6所述制备的脂质纳米粒混悬液混合并低速搅拌制成混悬液；灌装：将散装药液灌装至已成型的冷冲压成型复合硬片泡罩中；预冻：泡罩中药液至于-50℃～-70℃环境下使药液迅速冷冻成固态，或在-10℃～-70℃环境下连续梯度降温使药液迅速冷冻成固态；冷冻控制：载有冻结药液的泡罩置于-10～-15℃环境中8～24小时或在-20～-30℃环境中保持24～48小时后重新将温度降低至-40℃，固化的药液进行低温冰晶重排，结晶性辅料处分结晶，完成冷冻控制；冻干：冻干机设定搁板预冷模式，设定温度-20℃～-30℃，将装有已固化药液的泡罩放入冻干机中，开始进行冻干，冻干曲线如下表所示：表2 冻干曲线
包装：在相对湿度5～40%环境下覆铝纸复合膜，喷墨打印生产日期和批号。

技术总结

本发明提供了一种COVID-19口服耐热mRNA疫苗的组成成分及制备方法，本发明所述的COVID-19口服耐热mRNA疫苗是一种通过舌下粘膜递送、用于建立可靠黏膜免疫屏障的冻干舌下速溶片剂，具有在不高于20℃条件下运输、保存方便，使用方便、安全且有效建立黏膜免疫屏障并诱导全身免疫的优点。并诱导全身免疫的优点。