何 洋1，周黎黎1，刘红露2，李玉锋13
(1.西华大学生物工程学院，四川成都 610039;2.四川省疾病控制预防中心，四川成都 610031)
摘 要 基因芯片技术作为一种新的技术平台，已广泛地应用于食品研究领域。随着该技术的不断完善，其将在食品研究和食品安全中发挥越来越重要的作用。就基因芯片技术检测食品中常见致病菌的基本原理、检测过程、存在的问题、研究进展作一介绍。
关键词 基因芯片；致病菌；检测
中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2005)04-0092-03
Application of G ene Chip T echnology to Detect Pathogens in Food
HE Yang1,ZHOU Li2li1,L IU Hong2lu2,L I Yu2feng1
(1.School of Bioengi n.Xihua U niv.Chengdu610039;2.Sichuan Prov.Cent.of Diseases Prevention and Cont rol.Chengdu610031)
Abstract G ene chip technology as a new technology platform has been widely used in food study.With the continu2 ous perfection of this technology,it will play more and more important role in food study and food safety.Basic prin2 ciple,detection process,unsolved problems,research progress of it common in food detection were introduced.
K eyw ords gene chip,pathogen,detection
基因芯片(gene chip)技术是20世纪90年代兴起的前沿生物技术，它可以将生物学中许多不连续的分析过程，移植到固相的介质芯片上，并使其连续化和微型化。这对传统生物技术，如检测、DNA杂交、分型和测序技术将是重大的创新和飞跃。由于它横跨生命信息、生物物理等众多的研究领域，涉及生命科学、化学、计算机学、生物信息学等诸多自然学科，故已成为当今多学科交叉、综合的研究热点。基因芯片技术虽然仅有几年的发展历史，但在生物学的诸多领域已显示出巨大的潜力和诱人的前景。许多人认为基因芯片技术可以与单克隆抗体、PCR技术、重组DNA技术相媲美。针对DNA分析的芯片又称DNA芯片或基因芯片，根据核酸分析过程中的3个主要步骤, DNA芯片分为3类：用于核酸样品制备的DNA 芯片、用于核酸片段扩增反应的DNA芯片和用于基因检测的DNA芯片，后者又称微阵列，即DNA 芯片。本文对基因芯片在食品致病菌检测中的应用作一介绍。
1 基因芯片技术检测食品致病菌的技术原理
基因芯片的基本原理是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物[1]。
2 基因芯片技术在食品致病菌检测中的应用
2.1 致病菌在食品中的危害
食品在生产、运输、销售过程中容易受致病性微生物污染，因此食品卫生检验中的一个十分重
收稿日期:2005-04-01
作者简介：何洋 男，在读硕士研究生。研究方向为食品微生物检测。
项目来源：四川省应用基础研究项目(04J Y029205321)
3通讯作者
29微生物学杂志 2005年7月第25卷第4期 JOURNAL OF MICROBIOLO GY J uly2005Vol.25No.4
要的内容是及时准确地检测出食品中的致病性微生物。这些致病性微生物的存在会给消费者的健康带
来极大的危害。
2.2 常规方法检测食品中致病菌的不足
目前，国内外对食品微生物中病菌的检测包括常见的致病菌，如大肠杆菌、金黄葡萄球菌、志贺菌、沙门氏菌等，常规检测方法主要有传统生化培养检测法、探针杂交、PCR法。传统方法是采用细菌培养、生化鉴定与血清分型，由于操作简单、经济而被广泛采用，但检测时限长(一般要1～2周)，效率低、灵敏度不高。探针杂交和PCR 技术准确、灵敏、快速(PCR2～4h，探针杂交需要的时间稍长一些)，弥补了传统方法的不足，国内外关于这2种技术在医学微生物检测方面的研究报道很多。但PCR法由于假阳性影响及检测成本昂贵而在应用中受到限制；探针杂交操作繁杂、检测时限长，因此这两种技术并没有真正在实际检测中得到大量应用。可见常规检测方法检测食品中的致病菌已经不能满足快速检测的要求，难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域，因此为了确保食品的安全性，开发快速检测致病菌的方法，准确地检测食品中的致病菌具有十分重要的意义。
2.3 基因芯片技术检测食品中的常见致病菌
1996年，世界上第一块商业化DNA芯片的问世，标志着基因芯片技术进入广泛研究和应用的阶段[2]，该技术具有传统的检测方法不可比拟的优越性[3]:①基因芯片可以对食品中的致病菌实行高通量和并行检测，一次实验即可得出全部检测结果;②操作简便快速，整个检测在几小时内即可得出检测结果;
③特异性强，敏感性高。随着基因芯片检测食品中致病菌技术的不断发展和完善，将广泛应用于出入境、食品安全指标、突发事件等致病菌的检测，食品安全必将得到进一步保障，并且将对整个食品领域产生深远的影响。
东北农业大学动物医学院的立广兴制备了标记的空肠弯曲菌探针，北京医院临床检验中心的杨华卫等研制了2种以生物素标记对结核分支杆菌特异性的DNA探针[4]；李君文等[5]应用基因芯片检测水中常见致病菌：可对水中致病菌实行高通量、并行检测，一次实验即可得出全部结果；靳连等[6]利用基因芯片技术检测肠道中的致病菌。结果显示制备的基因芯片能够检测出沙门氏菌、志贺菌、葡萄球菌等。对于未知菌落利用基因芯片能够在3h完成对未知菌属的鉴定；南开大学王磊教授[7]承担的“致病肠道细菌—志贺氏菌检测基因芯片研制项目，近日取得重大进展，该项目针对不同种志贺氏菌特异基因及其探针已申请专利12项。利用基因芯片检测食品中志贺菌的时间已由传统检测方法的6d缩短到了几小时。
Borucki等[8]构建的混合基因组微阵列可准确鉴别各种近缘单核增多李斯特菌分离物; Volokhov等[9]通过单管复合体扩增和基因芯片技术检测和鉴别6种李斯特菌;Call等[10]通过分析 E.coli O157:H7的Shiga样毒素Ⅰ,Shiga样毒素Ⅱ及溶血素A，发现基因芯片可准确检测各种 E.coli O157:H7分离物。Jack[11]等通过设计通用引物扩增细菌核糖体16S rRNA，并将扩增产物与含有探针的低密度芯片进行杂交，从而直接检测鉴定微生物。Wilson等[12]采用病原体诊断区基因扩增和20寡核苷酸藻红素标记
探针，开发出一套多病原体识别微阵列，可以准确识别18种致病性病毒、原核生物和真核生物。
2.4 基因芯片技术检测食品致病菌的程序
2.4.1 PCR扩增引物及基因芯片探针设计 细菌间16S rRNA保守性强，在生物进化过程中比其他基因演化得慢，被冠之以细菌分类的“化石”。但细菌的16S rRNA保守性又是相对的，在16S rRNA基因中既有序列一致的恒定区，也有序列互不相同的可变区，恒定区和可变区交错排列。因此可以在16S rRNA恒定区设计PCR引物，用一对引物就可以将所有致病菌的相应基因片段全部扩增出来，可在可变区设计检测探针并制作基因芯片。
2.4.2 制备芯片 对芯片的介质表面进行氨基化、硅烷化或二硫键修饰处理是基因芯片技术的重要组成部分[13]。利用基因芯片点样仪，将引物及探针DNA分子点涂在经过修饰的玻片等载体上，即制成芯片。DNA芯片的制作有几种不同的方式:①芯片外合成制备芯片，如化学喷射法和接触式点涂法[14];②原位合成制备芯片，如高压电喷头合成法[15]和光引导原位合成法[16]。所用寡核苷酸均先已合成完毕，再固定于载体上。所用
39
4期 何洋等：基因芯片技术在食品致病菌检测中的应用
寡核苷酸均是在载体上被合成与固定，使成芯片。芯片制备好后，便可用于检测食品中未知致病菌。
2.4.3 待测食品致病菌样品处理 待测致病菌样品在培养后进行裂解，提取致病菌的模板DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增，对扩增出来的产物进行荧光标记。再用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的荧光标记产物可用于杂交试验。
2.4.4 杂交 将扩增后并已标记的待测致病菌DNA标品滴加于基因芯片上，与芯片上的特异性DNA进行杂交。被检测的致病菌如果存在，其DNA便与芯片DNA杂交成功，经洗涤晾干后，进行结果分析。
2.4.5 结果检测与分析 采用芯片扫描仪，如荧光扫描仪、共聚焦显微镜等进行检测，根据荧光的有无及强弱来确定被测致病菌是否存在。
3 基因芯片技术存在的问题及展望 基因芯片技术作为一种新技术，具有快速、准确、灵敏等优点，又能同时平行检测大量样本，但是目前还存在一些关键的问题亟待解决:①目前的基因芯片一般都采用荧光标记技术，使得基因芯片检测不仅需要昂贵的芯片制作系统，而且需要昂贵的激光共聚焦扫描仪，高昂的价格严重限制了这种芯片技术的普及应用;②操作复杂、费时，对操作人员的专业素质要求比较高，这也是限制其普及应用的障碍之一;③在样品目标物放大反应的过程中，容易造成样品污染，也会影响到检测信噪比，研究人员试图通过生物传感器吸附样品加以避免，并结合半导体技术、纳米技术和生物发光技术提高其灵敏度;④生物芯片微细制备技术以及如何提高生物芯片微阵列的密度也极
大地限制了该技术的市场需求，相信随着这些技术进一步完善，基因芯片技术完全可能成为21世纪最具活力的技术之一。
基因芯片技术在食品致病菌检测中是一个全新领域，国外已开始食品致病菌检测芯片的研究，但仍处于早期研发阶段。而在国内，该领域仍处于初步摸索阶段。基因芯片技术检测食品中致病菌在不久的将来必将会标准化、商品化，人们可望在一张芯片上检测到几乎所有致病菌，实现真正意义上致病菌检测的技术革命。
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49 微 生 物 学 杂 志 25卷
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