ｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４多态性抑制宫颈癌细胞的增殖作用及分子机制 苏俊玲 乌云 杨文静 张燕
基金项目：湖北省卫生计生委重点支撑项目（ＷＪ２０１７Ｚ００２）
作者单位：０１００１０呼和浩特，内蒙古自治区人民医院妇产科（苏俊玲，乌云，杨文静）；武汉大学人民医院妇产科（张燕）
【摘要】 目的 探讨ｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４多态性与宫颈癌临床特征相关性及对宫颈癌细胞增殖的影响作用与机制。
pgl3方法
应用病例对照研究方法，选取２０１２年６月至２０１８年１２月于内蒙古自治区人民医院就诊的宫颈癌
病人８
５７例作为实验组，同期８７３例健康志愿者作为对照组，两组年龄均在２３～６２岁，采用ＴａｑＭａｎ探针法对ｒｓ３７４６４４４位点的多态性进行基因分型；构建包含ｐＧＬ３ Ｓｏｘ６３′ＵＴＲ和ｍｉＲ ４９９的ＧＧ或ＡＡ的海肾荧光素酶载体（
Ｒｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｖｅｃｔｏｒ）于ｐｒｌ ｓＶ４０质粒中，并采用ｌｉｐｏ２０００转染人宫颈上皮永生化细胞Ｈ８和人宫颈癌细胞系：腺癌样ＳｉＨａ、上皮样ＨｅＬａ和Ｃ３３Ａ，ＣＣＫ ８法检测细胞增殖；双荧光素报告基因检测法分析Ｆｒｅｆｌｙ和Ｒｅｎｉｌｌａ荧光素酶活性；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｈｅｌａ和ＳｉＨａ细胞ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣｙｃｌｉｎＥ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６和Ｓｏｘ６蛋白表达。
结果
ＡＧ和ＧＧ
基因型宫颈癌发生风险分别是ＡＡ基因型个体的１ ０９倍和２ ４１倍，携带Ｇ等位基因的个体患宫颈癌的风险是ＡＡ基因型个体的１ ２８倍，ＧＧ基因型宫颈癌患者ＩＩＩ期及以上的比例显著高于ＡＡ基因型。ＧＧ表型肿瘤高度分化比例明显高于ＡＡ表型组，ｒｓ３７４６４４４不同基因型对正常宫颈Ｈ８细胞的增殖无显著影响。ｍｉＲ ４９９ＧＧ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ处理组Ｈｅｌａ、Ｃ３３Ａ和ＳｉＨａ细胞７２ｈ时ＯＤ４５０显著低于ｍｉＲ ４９９ＡＡ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ组，且高于Ｓ ｏｘ６ ３′ＵＴＲ组（Ｐ＜０ ０５）。ｍｉＲ ４９９ＧＧ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ处理组Ｈｅｌａ和ＳｉＨａ细胞ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣｙｃｌｉｎＥ、ＣＤＫ４和ＣＤＫ６显著高于ｍｉＲ ４９９ＡＡ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ组，低于Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ组（Ｐ＜０ ０５）。与ｍｉＲ ４９９ＡＡ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ处理组相比，ｍｉＲ ４９９ＧＧ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ处理组Ｓｏｘ６的表达水平增加（Ｐ＜０ ０５），且均低于Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ对照组（Ｐ＜０ ０５）。结论ｍｉＲ ４９９
的ｒｓ３７４６４４４突变（Ａ＞Ｇ）与宫颈癌肿瘤生长和分化程度密切相关，其通过上调Ｓｏｘ６介导的ＣｙｃｌｉｎＤ１高表达具有
明显的促进宫颈癌细胞生长增殖作用。
【关键词】 微小ＲＮＡ ４９９； Ｓｏｘ６； 宫颈癌； 细胞周期； 细胞增殖
ＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍ ＳＵＪｕｎｌｉｎｇ，ＷＵＹｕｎ，ＹＡＮＧＷｅｎｊｉｎ，ＺＨＡＮＧＹａｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓａｎｄｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａｐｅｏｐｌｅ′ｓｈｏｓｐｉｔａｌ，ＨｏｈｈｏｔＣｈｉｎａ，０１００１０
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ，ａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＣａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓｔｕｄｙｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄａｍｏｎｇ８５７ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｆｒｏｍＪｕｎｅ２０１２ｔｏＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１８ｉｎｔｈｅＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａｐｅｏｐｌｅ′ｓｈｏｓｐｉｔａｌ，ａｎｄ８７３ｈｅａｌｔｈｙｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓｗｅｒｅｉｎｃｌｕｄｅｄａｓｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅａｇｅｏｆｂｏｔｈｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅ２３～６２ｙｅａｒｓｏｌｄ．ＴｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆｍｉＲ ４９９ａｔｒｓ３７４６４４４ｗａｓｇｅｎｏｔｙｐｅｄｂｙＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅｍｅｔｈｏｄ．ＡｎｄｔｈｅｐＧＬ３ Ｓｏｘ６ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄＲｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｖｅｃｔｏｒｏｆＧＧｏｒＡＡｏｆ３′ＵＴＲａｎｄｍｉＲ ４９９ｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐｒｌ ｓｖ４０ｐｌａｓｍｉｄ．Ｌｉｐｏ２０００ｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｈｕｍａｎｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄｃｅｌｌｓＨ８ａｎｄｈｕｍａｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ：ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｌｉｋｅＳｉＨａ，ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄＨｅＬａａｎｄｃ３３ａ．ＣｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＣＣＫ ８ａｓｓａｙ；Ｔｈｅｌｕｃｉｆ
ｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｆｒｅｆｌｙａｎｄＲｅｎｉｌｌａｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｄｏｕｂｌｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅａｓｓａｙ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃｙｃｌｉｎＤ１，ｃｙｃｌｉｎＥ，ＣＤＫ４，Ｃｄｋ６ａｎｄＳｏｘ６ｉｎＨｅＬａａｎｄＳｉＨａｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｒｉｓｋｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｉｎｔｈｅＡＧａｎｄＧＧｇｅｎｏｔｙｐｅｓｗａｓ１ ０９ａｎｄ２ ４１ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅＡＡｇｅｎｏｔｙｐｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｉｓｋｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｃａｒｒｙｉｎｇｔｈｅＧａｌｌｅｌｅｗａｓ１ ２８ｔｉｍｅｓｔｈａｔｏｆｔｈｅＡＡｇｅｎｏｔｙｐｅ．ＴｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｐａｔｉｅｎｔｓａｔｓｔａｇｅＩＩＩａｎｄｈｉｇｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｅａｔｕｒｅｓｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＧＧｇｅｎｏｔｙｐｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＡＡｇｅｎｏｔｙｐｅ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｒｓ３７４６４４４ｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｎｏｒｍａｌｃｅｒｖｉｃａｌＨ８ｃｅｌｌｓ．ＴｈｅＯＤ４５０ｏｆＨｅｌａ
，Ｃ３３ＡａｎｄＳｉＨａｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ ４９９ＧＧ＋Ｓｏｘ６ ３′Ｕ
ＴＲｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｍｉＲ ４９９ＡＡ＋中国生育健康杂志２０２１年第３２卷第２期 ｈｔｔｐ：／／ｃｊｒｈ．ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲｇｒｏｕｐａｔ７２ｈ，ａｎｄｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＳｏｘ６ ３′ＵＴＲｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０ ０５）．ＴｈｅＣｙｃｌｉｎＤ１，ＣｙｃｌｉｎＥ，ＣＤＫ４ａｎｄＣＤＫ６ｉｎＨｅＬａａｎｄＳｉＨａｃｅｌｌｓｏｆｍｉＲ ４９９ＧＧ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｍｉＲ ４９９ＡＡ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲｇｒｏｕｐ，ｌｏｗｅｒｔｈａｎＳｏｘ６ ３′ＵＴＲｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０ ０５）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｉＲ ４９９ＡＡ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＳｏｘ６ｉｎｔｈｅｍｉＲ ４９９ＧＧ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０ ０５）．ＢｏｔｈｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅＳｏｘ６ ３′ＵＴＲｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０ ０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｒｓ３７４６４４４ｍｕｔａｔｉｏｎ（Ａ＞Ｇ）ｏｆｍｉＲ ４９９ｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ．Ｉｔｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｙｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｙｃ
ｌｉｎＤ１ｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＳｏｘ６．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ４９９； Ｓｏｘ６； ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ； ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ； ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
宫颈癌是一种宫颈上皮细胞高度分化的恶性肿瘤，位列全球女性常见癌症第四位［１］。根据国际癌症研究机构（ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｅｎｃｙｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＣａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ）的最新统计数据显示，全球宫颈癌患者高达近５２ ７万人，其中２０１８年有近３１ １万人死于此病，严重威胁着女性健康［１ ２］。虽然包括手术、放化疗在内的多种方式对宫颈癌都有不错的效果，然而其患者生存率依然极低［３ ５］。因此，深入解析宫颈癌发生发展分子机制有助于探究新的有效可行的策略。
临床数据显示，人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）ＤＮＡ检测为阳性被认为是宫颈癌发病的高危因素［６］。然而，健康妇女中亦有ＨＰＶ阳性表达，但是仅有少部分发展为宫颈癌［７］。因此，ＨＰＶ并非为宫颈癌的唯一诱因。近年来，越来越多的研究发现，基因遗传的多态性也参与宫颈癌的发生发展，然而机制不详［８］。微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ，ｍｉＲＮＡｓ）是一种长约１８～２５个核苷酸的高度保守的非编码ＲＮＡ，其与信使ＲＮＡ结合而调节基因的表达。ｍｉＲＮＡｓ调节机体的多个生理和病理学过程，包括癌症细胞的增殖分化、凋亡、侵袭和转移［９ １０］。有研究报道，ｍｉＲ ４９９通过与ＰＴＥＮ、ｐ２１和ＭＭＰ７结合，
促进口咽癌增殖、迁移和侵袭［１１ １２］，提示ｍｉＲ ４９９可能参与宫颈癌的发生发展。
最新研究证实，ｍｉｃｒｏＲＮＡ的遗传变异与宫颈癌发生发展相关［１３］。成熟ｍｉＲ ４９９基因ｒｓ３７３４６４４４位点单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）与宫颈癌和肺癌等多种癌症发生发展密切相关［１３ １４］。ｍｉＲ ４９９Ａ／Ｇ具有抑制凋亡作用［１５］。调控靶点包括转录因子Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ６和ＣＤ２００等［１６］，其中Ｓｏｘ６参与调控机体的多个生物学过程，包括红血球母细胞的增殖，中间神经节向皮质中心神经元的正常定位和成熟等［１６］。此外，Ｓｏｘ６参与调控子宫内膜癌、体外抑制白血病细胞增殖［１７］。由此可见，Ｓｏｘ６与癌症发病机制关系密切。然而，并未见Ｓｏｘ６在宫颈癌发生发展中相关报道。因此，本研究体外探讨ｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４位点多态性是否通过Ｓｏｘ６影响宫颈癌细胞增殖生长，为宫颈癌的诊断提供更好的生物标记和发病机制说明。
资料与方法
一、临床资料与样本采集
招募自２０１２年６月至２０１８年１２月于内蒙古自治区人民医院就诊的８５７例宫颈癌患者作为实验组（宫颈癌组），年龄２３～６２岁。病理类型包括腺癌（ｅｐｉｔｈｅｌｏｉｄｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＳＣＣ）５２３例、鳞癌２３４例和腺鳞癌９８例；根据国际妇产科联盟
（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙａｎｄＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，ＦＩＧＯ）之宫颈癌分期标准进行分期，其中Ⅰ期３４例、Ⅱ期２３８例、Ⅲ期３６３例、Ⅳ期２２２例。分化程度包括高分化３４例、中分化２３８例和低分化５６０例。８７３例同期健康志愿者作为对照组，年龄２３～６２岁。所选研究对象均由专业医师经盲法病理诊断证实，术前均未进行任何干预。根据临床病历获得包括年龄、癌症分期、肿瘤尺寸、淋巴结转移等临床病例特征信息、ＨＰＶ检测结果及实验组肿瘤大小及相关病理学检查结果。本研究经本院伦理委员会审核批准，所有研究对象均了解研究内容并签署知情同意书。
二、方法
１ 主要试剂与仪器：实验期间收集各组人外周血并分离血浆，宫颈癌患者收集肿瘤病变组织和癌旁组织共同冻存于－８０℃备用。人宫颈上皮永生化细胞Ｈ８和人宫颈癌细胞系，即腺癌样ＳｉＨａ、上皮样ＨｅＬａ和Ｃ３３Ａ细胞购自中国科学院上海细胞库，外周血全基因组ＤＮＡ提取纯化试剂盒与基因分型ＰＣＲＭｉｘ购自武汉擎科生物科技有限公司，ｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４位点ＴａｑＭａｎ探针引物购自上海生工生物科技有限公司，ｐｃＤＮＡ３ １ Ｓｏｘ６（ｃＤＮＡ全长序列）质粒购自北京奥科生物科技有限公司，Ｌｉｐｏ２０００、ＤＭＥＭ高糖培养基购自美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司，胎牛血清购自美国Ａｕｓｇｅｎｅ公司，ＣＣＫ 中国生育健康杂志２０２１年第３２卷第２期 ｈｔｔｐ：／／ｃｊｒｈ．ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
８试剂盒购自碧云天生物技术研究所，ＲＩＰＡ裂解液、Ｃｏｃｋｔａｉｌ、磷酸化酶抑制剂、ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒、ＥＣＬ显影液和ＨＲＰ 小鼠抗兔二抗购自武汉塞维尔生物技术有限公司，兔抗人Ｓｏｘ６、ｂ ａｃｔｉｎ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣｙｃｌｉｎＥ１、ＣＤＫ４和ＣＤＫ６抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。
２ 血液基因组提取和ｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４位点基因分型：抽取受试者５ｍＬ外周血，依据外周血全基因组ＤＮＡ提取纯化试剂盒，提取ＤＮＡ后检测ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比例，并冻存于－８０℃。取１０ｎｇ作为反应模板，按照ＴａｑＭａｎ探针法对ｒｓ３７４６４４４位点的多态性进行基因分型。引物序列为上游５′ ＣＡＡＡＧＴＣＴＴＣＡＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＡ ３′、下游５′ ＧＡＴＧＴＴＴＡＡＣＴＣＣＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣ ３′。根据说明书采用１０ｕｌ体系进行ＰＣＲ反应，完毕后在ＡＢＩ７９００ＨＴ仪器上读板，获得分型结果。
３ 构建基于荧光素酶的报告质粒：设计Ｓｏｘ６３′ＵＴＲ全长成对ＰＣＲ扩增引物、Ｓｏｘ６引物上游５′ ＧＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣ ３′、下游５′ ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴＣＡＴ ３′，将ＰＣＲ产生亚克隆到ｐＧＬ３ 无启动子荧光素酶的质粒中。设计针对人基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增引物，引物序列为上游５′ ＡＧＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＧＧＧ ３′、下游５′ ＴＧＧＴＴＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＡ ３′，基于ＰＣＲ的点突变构建含有ｍｉＲ ４９９的ＧＧ和ＡＡ基因型的ｐＳｉｌｅｎｃｅ２ １ Ｕ６质粒。
４ 双荧光素酶报告基因测定：接种于１２孔板的Ｈｅｌａ和ＳｉＨａ细胞，２４ｈ采用３ｍＬ的Ｌｉｐｏ２０００转染ｐＧＬ３ Ｓｏｘ６３′ＵＴＲ和ｍｉＲ ４９９的ＧＧ或ＡＡ的ｐＳｉｌｅｎｃｅ２ １ Ｕ６质粒４８ｈ后，收集细胞并用Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ酶标仪测量每组的荧光素酶活性，每组复孔３个，独立重复３次。
５ 细胞增殖实验：使用试剂盒 ８测定细胞活力。将细胞以每孔１×１０４个细胞的密度接种到９６孔板中；在２４ｈ后，加入ＣＣＫ ８溶液（每孔含１０μｌ，含有１００μｌ培养基）。将板在３７℃下孵育４ｈ，然后测量４５０ｎｍ处的吸光度。所有实验复孔３个，重复３次。
６ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验：用含有ＰＭＳＦ的ＲＩＰＡ裂解缓冲液裂解提取处理的Ｈｅｌａ和ＳｉＨａ总蛋白质，ＢＣＡ法检测蛋白浓度。３０μｇ通过在８％ＳＤＳ 聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白质，转移到ＰＶＤＦ膜上，５％ＢＳＡ封闭３０ｍｉｎ后，４℃一抗孵育１２ｈ。兔多克隆抗Ｓｏｘ６抗体（１∶８００），抗ＣｙｃｌｉｎＤ１抗体（１∶８００）和抗ＣｙｃｌｉｎＥ抗体（１∶８００），抗ＣＤＫ４抗体（１∶１０００）和抗ＣＤＫ６抗体（１∶１０００），以抗ｂ ａｃｔｉｎ抗体（１∶２０００）作为上样对照。ＨＨＲＰ 小鼠抗兔二抗ＩｇＧ二抗（１∶５０００）孵育１ｈ，并使用ＥＣＬ显影液显，以ＩｍａｇｅＪ分析灰度变化。
７ 统计学处理：应用ＳＰＳＳ２３ ０软件进行统计学分析，计量资料以（珋ｘ±ｓ）表示，两组比较
采用Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｔ检验，检验水平ａ为０ ０５（双尾），Ｐ＜０ ０５为差异有统计学意义，统计图均采用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ７ ０作图。
结 果
一、研究对象临床病理资料分析
结果如表１所示。宫颈癌组和对照组的年龄分布无明显差异。宫颈癌组ＨＰＶ１６阳性率为９７ ５％，ＨＰＶ１８阳性率为９６ ０％，明显高于对照组（ＨＰＶ１６为０ ２％；ＨＰＶ１８为０ １％），符合临床诊断标准。
表１ 宫颈癌病人临床病理参数特点［例（％）］Ｔａｂｌｅ１ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ［ｎ（％）］
Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
（Ｎ＝８７３）
Ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ
ｇｒｏｕｐ（Ｎ＝８５７）Ａｇｅ（ｙｅａｒ）
＜３０２６４（３０ ２）２８４（３３ １）
３０≤ ＜５５２５５（２９ ２）２４５（２８ ６）
≥５５３５４（４０ ６）３２８（３８ ３）
Ｔｕｍｏｒｓｉｚｅ（ｃｍ）
＜４—５７６（６７ ２）
≥４—２８１（３２ ８）
ＨＰＶ１６
＜３５（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）８７１（９９ ８）２１（２ ５）
≥３５（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）２（０ ２）８３６（９７ ５）
ＨＰＶ１８
＜３５（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）８７２（９９ ９）３４（４ ０）
≥３５（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）１（０ １）８２３（９６ ０）
Ｃａｎｃｅｒｔｙｐｅ
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ—５２５（６１ ３）
Ｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ—２３４（２７ ３）
Ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ—９８（１１ ４）
ＦＩＧＯｃａｎｃｅｒｓｔａｇｉｎｇ
Ⅰ—３４（４ ０）
Ⅱ—２３８（２７ ８）
Ⅲ—３６３（４２ ４）
Ⅳ—２２２（２５ ９）
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ｈｉｇｈ—３４（４ ０）
Ｍｏｄｅｒａｔｅ—２３８（２７ ８）
Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅ—５８５（６８ ３）
中国生育健康杂志２０２１年第３２卷第２期 ｈｔｔｐ：／／ｃｊｒｈ．ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
二、ｍｉＲ ４９９基因位点ｒｓ３７４６４４４基因型频率分布
ｍｉＲ ４９９基因ｒｓ３７４６４４４位点基因型频率分布结果如表２所示。Ｈａｒｄｙ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ遗传平衡定律检验ｍｉＲ ４９９基因ｒｓ３７４６４４４位点的基因型及等位基因频率在健康志愿者中的分布均符合遗传平衡，通过校正年龄的混杂因素影响后，ＡＧ和ＧＧ基因型宫颈癌发生风险分别是ＡＡ基因型个体的１ １倍和２ ４倍，携带Ｇ等位基因的个体患宫颈癌的风险是ＡＡ基因型个体的１ ３倍，差异均具有统计学意义（Ｐ＜０ ００１）。
表２ 宫颈癌患者和健康志愿者ｍｉＲ ４９９基因
ｒｓ３７４６４４４位点基因型频率分布
Ｔａｂｌｅ２ Ｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆ
ｍｉＲ ４９９ｇｅｎｅｒｓ３７４６４４４ｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ
ａｎｄｈｅａｌｔｈｙｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，ｎ（％）
ＧｅｎｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
（Ｎ＝８７３）
Ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ
ｇｒｏｕｐ（Ｎ＝８５７）
ＯＲ（９５％ＣＩ）
ＡＡ３３４（３８ ３）２６８（３１ ３）１
ＡＧ３０８（３５ ３）３１２（３６ ４）１ ０９（１ ０２ １ １１）ＧＧ２３１（２４ ５）２７７
（３２ ３）２ ４１（１ １５ １ ６７）Ｇｃａｒｒｉｅｒ５３９（６１ ７）５８９（６７ ５）１ ２８（１ １９ １ ４１）
三、ｒｓ３７４６４４４基因型在宫颈癌患者临床特征中的分层分析
宫颈癌患者中，ＧＧ基因型在５５岁及以上妇女中比例最低（９ ０％），与ＡＡ基因型（７１ １％）相比，差异具有统计学意义。ＧＧ基因型个体ＨＰＶ１６和ＨＰＶ１８型阳性率均比ＡＡ基因型高，差异具有统计学意义。从肿瘤尺寸来看，ＧＧ基因型宫颈癌患者肿瘤与ＡＡ基因型比较，差异无统计学意义。ＡＡ基因型中Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ和ＩＶ型癌症分期比例与ＧＧ基因型的癌症分布差异具有统计学意义，ＧＧ基因型宫颈癌患者ＩＩ期和ＩＶ的比例显著高于ＡＡ基因型。其次，从肿瘤分化程度来看，ＡＡ基因型患者肿瘤分化程度与ＧＧ基因型患者相比，两种基因型在肿瘤分化程度上的分布差异具有统计学意义。见表３。
四、ｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４基因型调节宫颈癌相关细胞体外增殖能力情况
为了研究ｍｉＲ ４９９ｒｓ３７４６４４４对Ｓｏｘ６蛋白表达与细胞增殖作用影响，通过构建突变质粒并转染细胞检测细胞活力。ｒｓ３７４６４４４不同基因型对正常宫颈Ｈ８细胞的增殖无显著影响（图１）。ｍｉＲ ４９９ＧＧ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ处理组Ｈｅｌａ、Ｃ３３Ａ和ＳｉＨａ细胞７２ｈ时ＯＤ
４５０
显著低于ｍｉＲ ４９９ＡＡ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ组，且高于Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ组（Ｐ均＜０ ０５）。
表３ ｍｉＲ ４９９基因位点ｒｓ３７４６４４４基因型
在宫颈癌患者临床特征中的分层分析［例（％）］
Ｔａｂｌｅ３ ＳｔｒａｔｉｆｉｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉＲ ４９９ｌｏｃｕｓｒｓ３７４６４４４ｇｅｎｏｔｙｐｅｉｎｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ，ｎ（％）Ｃｌｉｎｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓ
Ｇｅｎｏｔｙｐｅ
ＧＧＡＧＡＡ
Ａｇｅ（ｙｅａｒ）
＜３０１３２（４６ ５）１１５（４０ ５）３７（１３ ０） ３０≤ ＜５５１０９（４４ ５）９
７（３９ ６）３９（１５ ９） ≥５５３６（９ ０） １００（１９ ９）１９２（７１ １）Ｔｕｍｏｒｓｉｚｅ（ｃｍ）
＜４１９２（３３ ３）２１６（３７ ５）１６８（２９ ２） ≥４８５（３０ ２）９６（２４ ２）１００（３５ ６）ＨＰＶ１６
＜３５（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）１２（５７ １） ７（３３ ３） ２（９ ５） ≥３５（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）３２２（３８ ５） ３０１（３６ ０）２１３（２５ ５）ＨＰＶ１８
＜３５（Ｎｅｇａｔｉｖｅ） ６（１７ ６） ２１（６１ ７） ７（２０ ６） ≥３５（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）３２８（３９ ８） ２８７（３４ ９）２０８（２５ ３）Ｃａｎｃｅｒｔｙｐｅ
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ２０７（３９ ４）１５９（３０ ３）１５９（３０ ３） Ｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ１１４（４８ ７）１０３（４４ ０）１７（７ ３） Ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ１３（１３ ３）４６（４６ ９）３９（３９ ８）ＦＩＧＯｃａｎｃｅｒｓｔａｇｉｎｇ
Ⅰ１１（３２ ３） ６（１７ ６）１７（５０ ０） Ⅱ１１４（４７ ９） １１９（５０ ０） ５（２ １） Ⅲ１１１（３０ ６） ６５（１７ ９）１８７（５１ ５） Ⅳ９８（４４ １） １１８（５３ ２） ６（２ ７）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ｈｉｇｈ１１（３２ ４） ６（１７ ６）１７（２ ８） Ｍｏｄｅｒａｔｅ１８４（７７ ３）４３（１８ １）１１（４ ６） Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅ１３９（２３ ８）１４９（２５ ５）２９７（５０ ８）ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＡＡ， Ｐ＜０ ０５
五、ｍｉＲ ４９９Ａ／Ｇ对人宫颈癌Ｈｅｌａ和ＳｉＨａ细胞周期相关蛋白表达的影响
如图２所示，ｍｉＲ ４９９ＧＧ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ处理组Ｈｅｌａ和ＳｉＨａ细胞ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣｙｃｌｉｎＥ、
ＣＤＫ４和ＣＤＫ６显著高于ｍｉＲ ４９９ＡＡ＋Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ组，低于Ｓｏｘ６ ３′ＵＴＲ组（Ｐ＜０ ０５）。
中国生育健康杂志２０２１年第３２卷第２期 ｈｔｔｐ：／／ｃｊｒｈ．ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
图１ ｍｉＲ ４９９Ａ／Ｇ对不同宫颈癌细胞系增殖能力的影响
Ｆｉｇｕｒｅ１ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍｉＲ ４９９Ａ／Ｇｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅ
ｓ
图２ ｍｉＲ ４９９Ａ／Ｇ对宫颈癌Ｈｅｌａ和ＳｉＨａ细胞周期相关蛋白的影响
Ｆｉｇｕｒｅ２ ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ ４９９Ａ／Ｇｏｎｃｅｌｌｃｙｃｌｅ ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒＨｅｌａａｎｄＳｉＨａ
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