水杨酸-3-羟化酶通过调停水杨酸的分解代谢控制拟南芥叶片寿命 植物激素水杨酸（SA）在植物的防御机能、应激反应和衰老中起着重要的作用。尽管SA的生物合成（途径）已经被很好的了解了，但是SA是以哪种方式被异化分解代谢还是难以捉摸的。我们在叶片的衰老期中到一种涉及到SA的异化分解的物质—水杨酸-3-羟化酶，并在这篇文章中报道该酶鉴定方法和特性描述。在植物衰老期间，S3H（水杨酸-3-羟化酶）可以通过SA诱导的与植物衰老产生联系，并且是SA标准的负反馈调节系统中的一个关键部分。这种酶将SA（Km=58.29μM）转变为2,3-2羟基苯甲酸和2,5-2羟基苯甲酸在试管内但是仅仅2,3-2羟基苯甲酸是活泼的（估计是有活性的）。S3H淘汰的突变体未能产生2,3-2羟基苯甲酸糖耦合物（偶联物），因此积累了非常高水平的SA（这里估计指含量）以及SA的糖耦合物，然后使植物过早的呈现出衰老的迹象。相反的，pgl3S3H（突变产生了功能，估计能分解SA和它耦合物的S3H）列出了一个现象，包含高水平含量的2,3-2羟基苯甲酸耦合物以及极低水平的SA和它的耦合物，展示了一个令人注意的可以延长叶片寿命的能力。这篇文章揭示了一个简洁的SA异化代谢的机理即植物调节SA含量通过将SA转变为2,3-2羟基苯甲酸来阻止SA积累过多。这篇文章也提供了一个强有力的分子基因证据关于SA在调节叶片衰老的起始和评估（rate和onset）中起着重要的作用。 SA（水杨酸，又称2-羟基苯甲酸），是一种酚类化合物，已经被人类分析利用其医学价值200多年了，最近其作为一种植物激素在植物抗病、叶片衰老、开花和生热作用（产热机能）也已经被更多的研究开发出来。SA在植物防御功能和超敏反应（一种植物快速编程性细胞死亡的形式）中扮演的角也已经被集中地调查出来。叶片衰老是一种慢速的编程性细胞死亡，在这种过程中可以允许植物把衰老细胞中的营养品释放并运往种子、贮藏器官或者有活性的正在成长的组织。尽管有关SA在叶片衰老中所扮演的角还不是很清楚，但是这里还是有一些事实能证明SA的重要作用：在疾病预防和叶片衰老这两者似乎分享了SA的信号传递和管理中某些部件（成分）。
已经有更多的研究来指出SA的生物合成。在植物中，有两种SA的生物合成途径：1.PAL（苯基丙氨酸氨基裂解酶）途径和IC（异分支酸合成酶）途径。两种途径都是使用分支酸的初级代谢产物。这个分支酸衍生物L苯基丙氨酸能够被转化为SA通过中间产物苯酸盐或者香豆酸经过一些列的酶促反应涉及到PAL、苯甲酸-2-羟化酶和其他通用酶。分支酸也能够被转化为SA通过异分支酸在2个步骤的处理下，期间涉及到异分支酸合酶（ICS）和异分支酸-丙酮酸裂解酶。在拟南芥中，2分子的ICS酶能将分支酸转化为异分支酸已经被证实；在病原体和紫外光的诱导下90％的SA可以有IC途径产生。
在植物中，SA可能会经历生物学相关的化学修饰，比如糖基化、甲基化以及氨基酸配合。SA已经被展示可以转化为SA糖耦合物、SA O-β葡萄糖苷（SAG）和水杨酰葡萄糖酯通过SA葡糖基转移酶。这些水杨酸的配糖体会主动地从细胞液转移到液泡中作为一种不活跃的储存仓库为以后转化回SA做准备。甲基化的不活跃的SA仅仅增加了SA的膜通透性和挥发性，因此可以允许更有效的长距离运输这种防御信号。氨基酸配合的SA可以被追踪到在被感染的拟南芥中。最近，高水平的2,3-和2,5-2羟基苯甲酸糖耦合物被发现在被感染的或者老化的拟南芥叶片中，它们看起来主要是SA的不活跃形式。SA在转基因拟南芥中表达出了细菌性的水杨酸羟化酶（NahG基因编码）被引导转化为邻苯二酚；这个NagG转基因植物因此被广泛的应用到涉及SA的植物防御和衰老的研究中。然而，这种酶，可以对2，3-和2，5-2羟基苯甲酸的形式作出解释的酶，可推测为SA羟化酶至今还没有被鉴定出来。在这篇文章中，我们报道我们的发现和特性描述关于独一无二的SA3-羟化酶能够将SA转化为2,3-2羟基苯甲酸，SA主要贮藏形式2,3-2羟基苯甲酸糖耦合物的前导物以及在SA的分解代谢，体内平衡以及叶片衰老的调控起着重要的作用。
结果
SAG108/S3H是一个衰老相关的基因且能够被水杨酸诱导。在4g10500是早先被鉴定的作为植物衰老基因关联的基因叫做SAG108通过我们先前的关于叶片衰老的分析在拟南芥中，被发现其编码有功能的S3H在这里被描述。RNA印迹技术分析显示S3H转录产物累积在正在衰老的叶片中，但是几乎很少被检测到在未衰老的叶片中，显示与广为人知的衰老相关转录因子AtNAP（Fig.1A）表达出相同的模式。
S3H调节植物衰老的起始和过程。为了研究S3H的生物功能，一个转移DNA（T-DNA）插入一段序列（SALK-059907）作为特征。这个序列包含一个T-DNA插入S3H的第二个外显子完全禁止S3H的表达在纯合的突变体植物中，这个现象可以在RNA印迹中显示出来。这个S3H基因敲除的植物表现出引人注目的加速叶片衰老的表型通过与那些年龄一致的WT植物相比具有较低的叶绿素含量以及荧光含量与最大荧光含量的比值变小。然而，在初期阶段植物即种子发芽25天后发育表型看起来是正常的。Fv／Fm可以反映出光合系统2中的活性。
在S3H突变体中，叶片的衰老被加速主要有两个方面。首先，衰老速度加快。在WT植物中从叶片顶端到叶柄平均要9.5天才会衰老，而S3H突变体的叶片仅仅只用2.7天。第二，叶
片衰老的起始变早了（可以从叶端的黄看出来）；在S3H突变体出现这个现象的时间在16.8天以后，与WT出现的时间19.2天相比。更早的衰老起始和更快的衰老速度可以在叶片的存活曲线中显示出来。这个S3H的无效突变可以解释这个表型，因为有一个构件pGL3228运输完整的S3H（包括它的启动子区域）为WT植物修复S3H。
相反的，在WT植物中，由于花椰菜花叶病毒35S的引导（Fig.S2），S3H被过度表达时，叶片的衰老出现了令人注目的推迟（图Figs2D-F和3A），但是它的开花期却没有变化（Fig.3A）。如图Fig.2D，45DAGWT植物中的叶片开始衰老但是与年龄差不多的S3H过表达的植物叶片还是保持着绿。与9.5天的WT植物和2.7天的S3H相比，在S3H超表达系中需要14.6天叶端从叶柄衰老。在S3HOE中的叶片衰老起始有21.2DAE，与19.2DAE在WT植物中和16.8DAE在S3H中也推迟了。
衰老相关的基因和防御相关的基因这两种基因的表达在S3H中被加快而在S3HOE系中被推迟。为了增加对上述表型的特性描述，我们采用RNA印迹法对两种广泛使用的叶片衰老标记基因SAG12和SAG13以及3个SA信号传达的标记基因EDS1，PAD4和PR1，分别在WT，S3H和S3HOE系的处于不同年龄段的叶片（Fig.3B）进行分析。这个高含量的特殊
衰老的SAG12的转录产物被很清楚的检测到在35DAGS3H突变体和40DAGWT植物的叶片中检测到。同样的，SAG13，PR1，EDS1和PAD4也被发现出现过早的表达在S3H突变体中但是大大的抑制了过表达系。这些数据表明S3H调控衰老相关的基因和涉及到SA信号表达的基因。
S3H调停SA到2,3-2羟基苯甲酸的转化在植物中。采用液相谱法分析WT，s3h和S3HOE系中年轻和正在衰老植物的代谢产物。游离的水杨酸、水杨酸糖耦合物以及水杨酸衍生物包括2,3-和2,5-2羟基苯甲酸以及他们的糖耦合物的水平含量全部被总结在表格1中。
游离水杨酸的含量在年轻的或者正在衰老的S3H突变体叶片中为625％以及710％在WT植物，然而游离SA的浓度在S3HOE1系列中减少了10-12.5％。相似的，SAG的含量也增加到267％在s3h突变体中，317％在WT植物中。然而，SAG等级减少到无法检测的水平在年轻的和正在衰老的S3HOE1系列的叶片中。
与SA形成对比的是，游离的2，3-DHBA和2，5-DHBA的含量以及两种主要的SA代谢物在拟南芥中非常低以至于无法观测到，但是他们的糖耦合物的含量出现了戏剧性转变。在s3h突变体中，游离的SA和SAG被积累到一个很高的水平，正如上文提到的。然而，在新鲜的
叶片和正在衰老的叶片中，2,3-DHBA糖耦合物的总含量却无法检测到在s3h突变体中，反之，2,5-DHBA的含量增加到113％，在WT中增加到162％。恰恰相反的是，在S3HOE1叶片中，2,3-DHBA糖耦合物显著地增加到187％，在WT中增加到224％，但是，2，5-DHBA糖耦合物却明显的减少到43％，在WT中减少到40％。这些数据强烈的表明S3H将SA转化为2,3-DHBA在生物体内。
重组的S3H中拥有SA3-和5-羟化酶的活性。连续的分析表明S3H编码的蛋白与2-氧化戊二酸-Fe氧合酶家族酶相似（包括著名的F3H酶）都拥有保守的催化区Pfam PF03171（图S3和S4）。上述的植物化学的分析暗示着S3H催化SA分解为2,3-DHBA，我们采用生化分析来证明酶的活性通过使用在大肠杆菌中重组S3H酶的过表达。为了消除由于羟基自由基产生对SA的非酶氧化，我们加入了过氧化氢酶在每一个反应中为了出去羟基自由基。这个重组S3H酶将SA转化为2,3-DHBA和2,5-DHBA在二价铁、抗坏血酸盐、氧化戊二酸以及过氧化氢酶的参与下。这些由重组S3H酶产生的2,3-DHBA和2,5-DHBA有着相同的保留时间和紫外线光谱与在正常情况的产生的2,3-DHBA和2,5-DHBA（Fig.4B-D）。2，3-DHBA和2,5-DHBA的最大紫外光谱也是一个很好的特征（Fig.4E和F）。温度从4℃到40℃酶活性逐渐增加，温度从40℃到50℃酶活性逐渐降低，说明该酶的最适温度大约在40℃左右（Fi
gS5A）。酶活性的最适PH是6.0在我们的检测下（Fih.S5B）。在最适温度和最适PH的条件下，重组提S3H产生的SA的Km约等于58.29μM（Fig.4G）关于重组提S3H的底物专一性的测验，我们采用两种与SA有着相似结构的苯甲酸和，S3H酶在这两种化学物质中存在30分钟并未发生催化作用，可见重组S3H有着高的底物专一性。
我们的研究已经展示了一种独一无二负反馈管理机制通过植物调节其内源性的SA等级在植物叶片衰老的起始以及衰老过程中，并且提供强有力的分子基因证据来说明S3H通过调节SA的含量，对叶片衰老起着关键性的作用。
SA的生物合成和分解代谢对理解其生物学功能有着很重要的作用。PAL和IC两种途径已经被很好的研究以及也被建议是2种主要的SA的生物合成途径。然而，SA的分解代谢并没有被很好的理解。我们对于S3H的鉴别和特征描述揭露了一种植物调节SA水平的负反馈调节机制。简略的说，SA诱导产生了S3H，诱导产生的S3H酶反过来把SA水解为2,3-DHBA，即一种SA无活性存在形式，可以保护SA的过表达。
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