Vol. 49 No. 3
Mar. 2021
第49卷第3期2021年3月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of Northwest A&F University(Nat. Sci. Ed.)网络出版时间：2020-09-25 11：33 DOI ： 10. 13207/j. cnki. jnwafu. )021. )3 001网络出版地址：https ://kns . cnki. net/kcms/detai//61. 1390. S. 20200924. 1236. 001. html
牛
魏大为】，张久盘2，杨智燕】，王兴平】，罗仍卓么林森34
(1宁夏大学农学院(宁夏银丿H 750021' 2.宁夏农林科学院固原分院，宁夏固原756000；
3西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100； 4宁夏西海固高端牛产业研究院，宁夏中卫755
000)
［摘 要"【目的】探究牛大肿瘤抑制基因KLarge tumor suppressor gene1,LATS 1)的组织表达规律，并初步鉴 定其启动子区关键转录因子，以期阐明其转录调控机制)【方法】利用荧光定量PCR 检测LATS 1基因在牛心脏、肝
脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、大脑、皱胃及睾丸组织中的相对表达量。克隆牛LATS 1基因
启动子的全长序列，通过逐段缺失PCR 技术扩增7个缺失不同片段的启动子序列，并构建其双荧光素酶报告载体，分 别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系，通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性，确定LATS 1启动子核心区
域。使用在线软件预测牛LATS 1基因启动子核心区域的关键转录因子)【结果+LATS 1基因在大脑、背最长肌、大 肠、皱胃、肾脏中高表达。克隆了 1 950 bp 的LATS 1基因启动子序列及其7个逐段缺失片段序列，并成功构建了
pLATS1 — 1783/ + 167、pLATS1 — 1449/+167、pLATS1 — 1149/+167、pLATS1 — 837/ + 167、pLATS1 — 555/+ 167、
PLATS1 — 298/ + 167和pLATS1 — 123/+ 167双荧光素报告载体。检测到牛LATS 1基因启动子核心区域位于 — 298/ — 123区域。在线软件预测到牛LATS 1基因启动子核心区存在肌细胞增强因子2(MEF2A )、转录激活因子5
(STAT5)、同源异型盒基因5(HOXA5)、肌细胞决定基因1(Myod1)和靶向叉头框转录因子1(FoxO1)结合位点)【结
论】克隆了牛LATS 1基因启动子，明确了其核心区位于一 298/— 123区域；MEF2A 、STAT5、HOXA5、Myod1和
FoxO1可能对牛LATS 1基因转录活性具有重要的调控作用)
［关键词"牛LATS 1基因；启动子；转录调控
［中图分类号］S823. 8Z 1 ［文献标志码］A ［文章编号］1671-9387(2021)03-0001-08
Transcription regulation analysis of bovine LATS1 gene
WEI Dawei 1 , ZHANG Jiupan 2
,YANG Zhiyan 1
,WANG Xingping ,
LUORENG Zhuoma 1 ,ZAN Linsen 3
4
(1 School of Agriculture ( Ningxia University ,Yinc&uan (
Ningxia 750021, China
' Guyuan Branch of Nigeria Academy of Agriculture
and Forestry Sciences ( G uyuan ( Ningxia 756000 , Ch i na ；
3 College of An i mal Science and T e chnology ( Northwest A @F University ( Yangling ( Shaanxi 712100 , China ；
4 N i ngxia Xi h a i g u High-end Cattle Industry Research Ins t i t ute ( Z hongwe i ( N i ngx i a 755000 , Ch i na )
Abstract : ［Objective ! Aiming to elucidate the transcriptional regulation mechanism of bovine large
tumor suppressor 1 gene (LATS 1) , this study explored the expression level of LATS 1 gene in different tis- suesofcatlean@i@entifie@thekeytranscriptionfactorsinthepromoterregion.*Metho@+RealtimeWCR
wasuse@to@etecttherelativeexpressionofbovine LATS 1geneinheartliverspleenlung ki@ney subcu- taneousfat (longissimus@orsi (largeintestine (smalintestine (brain (abomasum ********************** full-length sequence of bovine LATS 1 gene promoter was cloned and the luciferase reporter constructs with
［收稿日期& 2020-02-26
［基金项目&宁夏重点研发项目(引才专项X2020BEB04011)；宁夏托举人才工程项目(TJGC2019076)；宁夏大学科研启动金项目
(030900002032)；宁夏科技重大专项(2019BEF02004)
［作者简介&魏大为(1989 — )男，甘肃通渭人，副教授，博士，主要从事牛肉质候选基因筛选及鉴定研究。
E-mail ： weidaweiwdw@ 163. com
［通信作者& k 林森(1963 — )，男，陕西扶风人，教授，博士生导师，主要从事牛遗传改良与动物生长发育调控研究。
E-mail : zanlinsen@ 163. com
2西北农林科技大学学报（自然科学版）第49卷
seven different deletion fragments of LATS1gene promoter were constructed and transfected into C2C12 and3T3-L1cell lines,respectively.The key transcription factors in core promoter regions of bovine LATS1 were also predicted using on-line software.【Result】The bovine LATS1gene was highly expressed in brain,longissimus dorsi,large intestine,abomasum and kidney.A1950bp promoter region sequence of bovine LATS1gene and seven deletion fragments were cloned.The luciferase reporter vectors of pLATS1—1783/ +167,pLATS1—1449/+167,pLATS1—1149/+167,pLATS1—837/Z
167,pLATS1—555/+167, pLATS1―298/+167and pLATS1―123/+167were successfully constructed.The core promoter region of bovine LATS1gene was located at―298/―123bp.The online software predicted myocyte enhancer factor 2A(MEF2A),activator of transcription5(STAT5),homeobox A5(HOXA5),myogenic differentiation1 (Myodl)and forkhead box01(Fox01)transcription factors binding sites on the bovine LATS1gene.
[Conclusion!The bovine LATS1gene promoter was cloned and its core promoter was located at―298/—123bp.MEF2A STAT5(H0XA5(Myod1,ndFox01m,ypl,yimport,ntrolesintheregul,tionofbo-
vine LATS1genetr,nscription,ctivity.
Key words：bovine；LATS1gene；promoter；transcriptional regulation
我国肉牛产业虽起步较晚、起点较低，但发展势头迅猛）2019年我国牛肉总产量约770.0万吨，同年我国牛肉消费量为923.3万吨%1〕。目前我国牛肉消费供不应求，价格持续高位运行，不得不从国外大量进口，2019年牛肉进口量高达165.95万吨，比2018年增加61.99万吨，首次跃居全球首位%1。据预测，未来5年内，我国牛肉年消费量将突破1000万吨，如果按照目前的生产水平，至少还有300万吨左右的缺口%12。因此，我国肉牛产业还有很大的发展空间。秦川牛作为我国五大黄牛品种之一，具有耐粗饲、抗逆性强、肉质细嫩且大理石花纹明显等特点3，但其产肉率低、生长速度缓慢、后躯不够
发达等缺点制约了其产业化发展4。如何提高秦川牛生长速率，增加产肉量，改良和培育优良的肉牛品种成为目前肉牛产业的重要研究方向。研究表明，动物的骨骼肌与其产肉性能密切相关其发育状况除了与环境及营养水平等有关外，更多地受基因控制6。因此，通过筛选功能基因来提高骨骼肌的生长发育水平并改善肉质成为现代肉牛遗传改良的一项重要研究内容。
大肿瘤抑制基因1（LATS1）作为Hippo通路主要成员之一，在组织器官的形成及胚胎干细胞的增殖与分化中扮演着重要角%78。目前关于LATS1研究主要肿瘤作用方面⑷，而有关其调控畜禽骨骼肌生长发育的报较少，%10，LATS1与
生长性状存在一定的关联性。本研究利用实时荧光定量技术，检测LATS1基因在牛不同组织中的表达情况，同时克隆LATS1基因启动子序列，通过逐段缺失PCR扩增获得缺失片段的启动子，并构建双
，将
，LATS1基因启动，进一通过在线网站预测影响牛LATS1基因的关键转录因子，以期初步阐明其转录调控机制，为牛的分子育种提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1组织样$采集3头秦川牛公牛（24月龄）
及、、、、、、背最长肌、大肠、小肠、大脑、皱胃及睾丸组织，于液
。
1.1.2主要试剂总DNA提取试剂盒、总RNA 提取试剂盒、PrimeScript™RT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、SYBR@PrimixEx Tag™H荧光定量试剂盒、PMD19-T（simple）载体、T4DNA连接酶、高保真PCR扩增酶GXL、大肠杆菌DH5#感受态细胞，均购自TaKaRa公司；限制性内切酶Kpn l Bin d皿，购自美国NEB公司；DNA 胶快速回收试剂盒、质粒提取试剂盒、pGL3-Basic 质粒及双荧光素酶基因内参pRL-TK载体、Dual-Luciferase®Reporter Assay System双荧光素酶报告系统，均购自Promega公司；PBS、DMEM培养基，购自Hyclone公司；Lipofectamine3000Reagent 转染试剂盒，购自Invitrogen公司；胎牛血清、0P-TI-MEM培养基，购自Gibco公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
第3期魏大为，等：牛LATS1基因启动子转录调控分析3
1.2牛不同组织中LATS1基因mRNA表达水平
的检测
提取牛不同组织总RNA，用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA质量。使用PrimeScript TM RT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,—20°C冰箱保存备用。
选用GAPDH作为内参基因，采用实时荧光定量PCR检测牛不同组织中LATS1基因mRNA的表达水平。根据NCBI公布的牛LATS1基因序列(GenBank登录号：NM_001192866,1)和GAPDH 基因序列(GenBank登录号:NM_001034034.2)，采用Primer premier 5.0软件设计LATS1GAPDH引物(表1)，用SYBR®PrimixEx Taq™H荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR，检测LATS1基因在各待测组织中的表达情况。PCR反应体系为20'L，其中PrimixEx Taq H为10'L，上、下游引物各0.8'L,R0X Reference Dye H0.4'L,cD-NA模板2'L,ddH206'L。反应在7500Real Time PCR仪(ABI公司产品)上进行。反应条件为：95C预变性30s；95C变性5s,60C退火34s，循环40次，进行3个生物学重复试验，采用2-法分析相对表达量%11，数据使用SPSS软件进行单因素方差分析。 Table1Primers used in real time PCR 表1实时荧光定量PCR引物信息
基因Gene
引物序列(5/"3，)”
Primer sequence(5"3)
退火温度/C
Tm
扩增片段长度/bp
Productlength
扩增区域
Amplifiedregion
GAPDH F：CCAACGTGTCTGTTGTGGAT
R：CTGCTTCACCACCTTCTTGA
60.080320―521
LATS1F：GTTGGTAGGACAGCCGCCTTTC
R：GCTTGCGGTGGGATGTGAAGAG
60.0963310—3406
1.3牛LATS1基因启动子序列分析及蛋白序列
进化树构建
利用NCBI(https：//bi.v)数据库中海福特牛(Hereford)基因组信息，确定LATS1基因DNA序列。结合NCBI公布的牛LATS1基因转录起始位点及Ensembl(https：/// index,html)网站，初步预测牛LATS1基因启动子位置。使用MEGA 5.0(https：//asof--ware/index.php)和Uniprot(www. uniprotorg/"析牛LATS1基因,
建不同物种LATS1蛋白进化树。
1.4牛LATS1基因启动子的克隆
提取牛血液样本基因组DNA,4C保存备用。
表2利用牛LATS1基因的启动子序列(GenBank登录：NC_0373361",Primer50引物
LATS1-PF和LATS1-PR(表2)。以血液基因组DNA为模板，PCR扩增秦丿11牛LATS1基因启动子区一1
783/+167片段。PCR反应体系为50'L，其中含2XPrimeSTAR GXL Buffer25'L，上、下游引物(10'mol/L)各2'L,50ng模板，2U PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，用ddH20补齐。反应条件：98C预变性5min；95C10s,60C20s, 68C15s,35个循环。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化，连接于PMD19-T(Sim-ple)载体并转化到大肠杆菌DH5#感受态细胞中，进行单克隆筛选后测序。
牛LATS1基因启动子及其逐段缺失片段克隆引物
Primers used in promoter and deletion fragment cloning of LATS1gene Table2
用途Useage
引物名称引物序列(7)温|火C长t/p A土p f；Primer name Primer sequence(5/"3/)温阜/C长度/bp Amplified
Tm Productlength region
启动子克隆Promotercloning LATS1-PF CGACTGAGCGACTGAACTGAAG65.51950—178#/+167 LATS1-PR GCCGCCATTTTGCCTTTCACTCG
启动子逐段
缺失片段克隆promoter deletion fragments cloning LATS1-P1CGGGGTACC CGACTGAGCGACTGAACTGAAG64.01950—178#/+167
LATS1-P2CGGGGTACC TACACCCGAAACTAGCACAA61.51616—1449/+167 LATS1-P3CGGGGTACC CTTCACAGGAATAAACCTCTT6#.51#16—1149/+167 LATS1-P4CGGGGTACC GGGTCATATCTTCTACAGACT65.01004—8#7/+167 LATS1-P5CGGGGTACC CAAAGGAGCTCTGTACAATG61.5722—555/+167 LATS1-P6CGGGGTACC AGTGCTAAGCAAAATTCTAG62.0465
—298/+167
LATS1-P7
CGGGGTACC AGACACTGAAATACTTGAGT59.5290
—12#/+167 LATS1-R CCCAAGCTT GCCGCCATTTTGCCTTTCACTCG
注：斜体碱基CGGGGTAC^CCCAAGCTT分别为Kpn$和H1d皿酶切位点。
Note：The italic bases of CGGGGTACC and CCCAAGCTT are Kpn$and Hin d%restriction sites,respectively.
4西北农林科技大学学报（自然科学版）第49卷
1. 5牛LATS 1基因启动子核心区分析
1.5.1启动子逐段缺失片段的克隆 为进一步确
定牛LATS 1基因启动子核心区域，用Primer
premier 5. 0软件设计7条用于启动子逐段缺失片
段扩增的上游引物LATS1-P1、LATS1-P2、LATS1 -
P3、LATS1-P4、LATS1-P5、LATS1-P6 及 LATS1-
P7和1条固定的下游引物LATS1-R （上、下游引物
5'端分别添加Kpn l z n d 皿双酶切位点，引物信
息 2）。
正确的牛LATS 1基因启动 ：—1783/ + 167
作为 进行启动PCR （扌 及 ）, 进行测序鉴定。
1.5.2双荧光素酶报告载体的构建使用内切酶
K P ”I 和Hin d 皿在37匕下双酶切pGL3-Basic 载
1 h，用T4 DNA 连接酶在16 °C 恒温仪上与经同
切的7个牛LATS 1基因 启动子片，将
物转化大肠杆菌DH5#感旻
胞，挑选阳性单 落进行
切鉴定。将正确
单
大 夜，使用去内毒 盒 ：
质粒。重组质粒分别命名为：PLATS1 — 1783/
+ 167、p LATS1 — 1449/+ 167、pLATS1 — 1149/ + 167、pLA-TS1 — 837/+ 167、pLATS1 — 555/ + 167、pLATS1 — 298/+ 167 和 pLATS1 — 123/ + 167，并进行纯度和浓度测定。1.5.3
双荧光素酶报告载体活性分析 用含体积 分数 10% 胎牛血清（fetal bovine serum, FBS ）的
DMEM 基 （C2C12））肪
细胞（3T3-L1）系，按每孔1X105个细胞的量接种至
24孔板，置于37 C 、体积分数5% CO 2埠
养, 单层长至70%〜80%融合时 。分别
将构建的800 ng 牛LATS 1基因启动子5'端缺失片 段重组质粒和20 ng 内参质粒pRL-TK 共转染
C2C12和3T3-L1细胞，按照Lip3000转染试剂盒
说明进行试验操作，以pGL3-Basic 质粒为阴性对
照，每组试验重复3次。 48h 后收 。使
用Promega
盒 萤火虫荧
F 值））
（R 值），通
算其比值（F/R ）确定LATS 1基因启动子核心 。数据 SPSS
两个独立
t 检验
进行方差分析。
1.6关键转录因子预测
通
Genomatix （htp ：//-
pgl3
matix.de /cgi-bin //mat-inspector ）、 JASPAR （ht- tp ：//jaspar. genereg. net/）预测启动子核心区潜在
合因子，设置阈值大于90%，根据预测
进行数据库比 交集进行筛选，标注牛LATS 1基因启动
因子结合序列。
2结果与分析
2. 1牛不同组织LATS 1基因的表达规律
LATS 1基因mRNA 在秦川牛不同组织中的相
对表达量如图1所示。
8
6
4
2
u .2S S O J d x o v
n m e
OAHEI&
•*M «aA T
bB T
bB T
bB +
cb h
^
i
CB +
^
t t
CB
土
c B
][图柱上标不同小写字母表示组织间差异显著（F V0. 05），标不同大写字母表示差异极显著（F V0. 01）Different lowercase letters mean significant difference among different tissues at J <0. 05 and different capital
letters mean extremely significant difference at J <0. 01
图1 LATS 1基因mRNA 在牛不同组织中的相对表达量
Fig.1 mRNAexpressionof LATS 1geneindiferenttissuesofcatle
图1显示,LATS 1基因在牛12
组织 有表达， 达量为参照LATS 1基因
^
4
第3期魏大为，等：牛LATS 1基因启动子转录调控分析5
在大脑中的相对表达量极显著高于其他组织（P <
0.
01）；在背最长肌、大肠、皱胃,
达量显著、睾丸, 、肺脏、心脏、肝脏及小肠组织（P <0. 05）。结果表明，LATS 1基因可能与秦 川牛器官发育紧 ，尤其在大脑以及肌肉组织
发育中起重要作用。
2.2牛LATS 1基因结构及蛋白序列进化分析牛 LATS 1 基 因 9 （ENS-BTAG00000015076， 86860562-86897588 ）， 长 37 027 bp 。LATS 1 基因开放阅读框（0pen reading frame,0RF ）为3 372 bp，包括8个外显子（外显子
1 — 8）和7个内含子（内含子1 — 7），编码1 123个氨
基酸，分子质量为126. 19 ku 。在线网站预测到牛
LATS1为不稳定水溶性蛋白，无潜
信号肽剪切
位点。以NCBI 及Ensembl 数据库公布的牛
LATS 1基因信息，确定其转录起始位点胞WX （C ）
为+ 1位置，向上游查2 000 bp 列，初步预测
启动 。 MEGA 物种（绵
、山羊、马、猪、小鼠）LATS1蛋白质序列进化树,
结果（图2）表明，LATS1蛋白在不同物种中相似度 较高，尤 复胃动物（牛、绵 山羊）间进 W
。
牛Bostaurus (NP001179795.1)
'apra hircus (XP017908824.1)Ovis aries (NP 001293042.1)
猪 Sus scrofa (XP0056 59206.2)
------------------------------马 Equus caballus (XP023488894.1)
--------------------------------------------------------------------------才\ Mus musculus (XP023 488894.1)
0.01
图2牛LATS1蛋白序列进化树
Fig2 Evolutionarytreeofbovine LATS 1proteinsequence
2.3牛LATS 1基因启动子片段的扩增据牛LATS 1启动 信息 引物PCR 启动子区，结果（图3）获得了约1 950 bp 的
单一
，无杂带。目 经
长度为1950bp
。
1
2 000bp 250bp lOObp
lOOObp 750bp
500bp
M
M DL2000DNA Marker1 启动 —1783/+167
M DL2000DNA marker ;1 Amplificationof
—1783/+167promoterregion
图3牛LATS 1基因启动子片段的PCR 扩增
Fig3 PCRamplificationofbovine LATS 1genepromoter
2.4牛LATS 1基因启动子核心区分析
2. 4. 1 启动子逐段缺失片段的扩增 使用 LATS1-P1/LATS1-R ）LATS1-P7/LATS1-R 等7
对逐段缺失引物进行牛LATS 1启动子区
果（图 4）分别获得了 1 950,1 616,1 316,1 004,722,
465 290bp 单一 （与 期 长 一 。
lOObp
2000bp lOOObp 750bp 500bp
M 1
2 3 4 5 6 7
250bp M. DL2 000 DNA Marker ；〜7.分别为 LATS1-P1/LATS1-R )LATS1-P7/LATS1-R 扩增产物，长度分别为1 950,1 616，
1316 1004 722 465 290bp
M DL2000DNA marker ;1—7 AmplifiedproductsofLATS1-P1/
LATS1-R —LATS1-P7/LATS1-R (with lengths of 1 950 1 616(
1316 1004 722 465and290bprespectively
图4牛LATS 1基因启动子逐段缺失片段扩增电泳图
Fig4 Gelelectrophoresisofdeletionfragmentsof
bovine LATS
1genepromoter
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