《中国癌症杂志》2020年第30卷第6期 CHINA ONCOLOGY 2020 Vol.30 No.6
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通信作者：黄 诚 E-mail: cheng671@sina
PI3K/AKT通路通过Nrf2途径调控PD-L1在非小细胞肺癌中的表达 王 静，陈 洁，胡 春，黄 诚
福建医科大学附属厦门弘爱医院肿瘤科，福建 厦门，361009
［摘要］ 背景与目的：程序性死亡［蛋白］配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）在肿瘤细胞中的表达对肿瘤逃避机体免疫监视具有重要的意义，其表达通常受MAPK 、PI3K-AKT 或STAT3等多条通路的影响，但这些通路具体经哪个关键环节尚不明确。拟通过PI3K/AKT 信号通路对肺癌细胞A549、H460中PD-L1表达的调控具体机制进行探究。方法：使用shRNA 技术选择性地沉默A549、H460细胞中的HEB 、HTF 4、Nrf 2及FOXO 3a 等基因，构建缺陷细胞株；将目的基因PD -L 1的3’UTR 区域构建至pGL3-basic 载体中，通过luciferase 双报告基因体系检测PD -L 1转录激活情况，并使用实时荧光定量聚 合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ，RTFQ-PCR ）技术验证细胞内PD -L 1基因转录的情况；通过蛋白质印迹法（Western blot ）检测细胞内PD-L1的总表达情况；免疫细胞与肿瘤细胞共培养，检测Nrf 2基因敲除前后，人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells ，PBMC ）对A549、H460细胞株的杀伤效果。结果：经10 μg/mL 的insulin 刺激后，A549、H460细胞株中蛋白激酶B （AKT ）基因磷酸化水平显著增强，伴随着PD -L 1基因的转录水平和表达水平显著增强（P <0.001），在HEB 、HTF 4及FOXO 3a 基因敲除的细胞株中，情况相似，而在Nrf 2基因敲除的细胞株A549（A549Nrf 2-）和H460（H460Nrf 2-）细胞株中，PD -L 1的转录和表达水平则与阴性对照组一样未见明显变化（P >0.05）；活性氧（reactive oxygen species ，ROS ）诱导剂isoproterenol 能提高A549、H460细胞株中PD -L 1基因的转录和表达水平，而ROS 在被NAC 解除后，PD -L 1的转录和表达水平显著下调，进一步证明Nrf 2对PD -L 1基因的转录调控作用；wortmannin 能逆转insulin 刺激引起的AKT 磷酸化水平增加，促进PD -L 1基因的转录水平和表达水平下降，表明PD -L 1的调控与AKT 激活程度相关；在insulin 和wortmannin 的分别干预下，A549、H460细胞株中的Nrf 2磷酸化水平能随着AKT 磷酸化水平改变而改变，二者相关系数r 分别为0.86和0.93，为强正相关；Nrf 2敲除后，A549、H460细胞株与PBMC 共培养后凋亡数量显著增加。结论：PI 3K /AKT 通路对肺癌细胞A549、H460中PD-L1表达具有关键调控作用，该调控是通过磷酸化激活Nrf 2而实现的。 ［关键词］免疫监视；PD-L1；肺癌DOI: 10.19401/jki.1007-3639.2020.06.003 中图分类号：R734.2 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2020)06-0419-09
PI3K/AKT regulates the expression of PD-L1 via Nrf2 pathway in non-small cell lung cancer WANG Jing, CHEN Jie, HU Chun, HUANG Cheng (Department of Oncology, Xiamen Humanity Hospital Affliated to Fujian Medical University, Xiamen 361009, Fujian Province, China)
Correspondence to: HUANG Cheng E-mail: cheng671@sina
［Abstract ］ Background and purpose: Programmed death ligand-1 (PD-L1) plays an important role in sheltering tumor cell from surveillance of immune system. While the potential modulation is regarded as being performed at MAPK, PI3K-AKT and STAT3 pathway in most cases, the key control point has never been explicitly reported. This study aimed to probe on this mechanism of lung carcinoma via PI3K/AKT pathway based on the A549 and H460 cell lines. Methods: By using shRNA technology, we created several selectively ‘silent’ mutations of A 549 and H460 cell lines, involving A549HEB -, A549HTF 4-, A549Nrf 2- A549FOXO 3a -, H460HEB -, H460HTF 4-, H460Nrf 2- and H460FOXO 3a -. 3’UTR region of PD -L 1 was constructed into pGL3-basic vector in order to create a dual luciferase reporter gene system which was able to be used for monitoring the transcriptional activation of PD -L 1. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) was used to detect the transcriptional level of PD -L 1, and the Western blot assay was used for monitoring the total expression of PD -L 1; peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) co-culturing
with A549 and H460 cell
420王 静，等 PI3K/AKT通路通过Nrf2途径调控PD-L1在非小细胞肺癌中的表达
程序性死亡［蛋白］配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是一种相对分子质量为4×104的跨膜蛋白，由CD274基因编码［1］。早期被发现在机体某些特殊时期增量表达，如妊娠、自身免疫性疾病及各种病毒感染等［2﹣3］。近年研究发现，PD-L1在多种肿瘤细胞中均呈高表达，参与对机体的免疫抑制［4﹣5］。PD-L1可以与免疫T细胞表面的程序性死亡［蛋白］-1 （programmed death-1，PD-1）结合，致使T细胞失去免疫识别活性，无法杀伤肿瘤细胞［6﹣7］。肿瘤的发生、发展一方面与其自身恶性程度有关，另一方面也决定于其对免疫系统的破坏能 力［8﹣9］。因此，PD-L1的表达水平直接影响患者的预后，通过人工干预降低其在肿瘤细胞中的表达，也成为促进免疫系统恢复、遏制肿瘤的潜在手段之一［3，10﹣11］。AKT又名蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），其活性受磷脂肌酰醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）调控，同时又调控着细胞多条信号通路，在细胞存活和凋亡中起重要作用。多项研究发现，AKT在许多肿瘤细胞中处于较为活跃的状态，其异常活性常引起多条信号通路的异常激活，并赋予肿瘤细胞异于正常细胞的能力，包括无限增殖、侵袭、抗逆性及抗免疫等［12﹣13］。
前期实验中，我们发现非小细胞肺癌A549细胞在经PI3K抑制剂wortmannin处理后，细胞中PD-L1的
表达与AKT去磷酸化出现同步下调，根据AKT在细胞通路中的作用关系网，我们推测这种下调可能是通过抑制某些转录因子的活性而实现的。基于以上假设，我们通过短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）技术同时构建了一些A549细胞和H460细胞的转录因子缺陷株，这些转录因子均被报道受AKT调控，如HeLa细胞系E-box结合蛋白（HeLa E-box binding protein，HEB）、螺旋环螺旋转录因子4（helix-loop-helix transcription factor 4，HTF4）、NF-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）及叉头盒蛋白O3（forkhead box O3，FOXO3a）等，以明确AKT通过转录因子调控PD-L1在肿瘤细胞内表达的机制。
1 材料和方法
1.1 试剂与仪器
实验所用人非小细胞肺癌A549及H460细胞及pGL3-basic载体均由本实验室保存。细胞培养在含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640（购自美国Gibco公司）培养基中，细胞共培养所有培养基Lonza X-VIVO™ 15购自美国Lonza公司；人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）购自美国ZenBio公司；用于基因沉默的shRNA（HEB、HTF4、Nrf2及FOXO3a）均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。用于抑制PI3K活性的抑制剂wortmannin购自美国MedChemExpress公司。所用一抗为鼠抗，分别为抗Nrf2、抗pNrf2、抗PD-L1、抗AKT、抗pAKT（Ser473）购自美国Cell Signaling公司；二抗为兔抗鼠抗体，购自美国DAKO公司。用于 lines were utilized to check the function of Nrf2 in tumor immune resistance. Results: Phosphorylation level of AKT and expression level of PD-L1 in A549 and H460 cell lines were simultaneously enhanced after treatment with 10 μg/mL insulin (P<0.001), and the same phenomenon was observed in their mutations with defect in HEB, HTF4 and FOXO3a respectively, however, the plot reversal occurred in A549Nrf2- and H460Nrf2- cell lines (P>0.001). Isoproterenol could boost both transcriptional activation and expression level in A549 and H460 cell lines, and this auto-action was able to be relieved by NAC. Results above further certified the transcriptional regulation of Nrf2 on PD-L1 gene. Wortmannin could change over the function of insulin to raise the expression of PD-L1, by prohibiting the increasing AKT phosphorylation level. Furthermore, the relationship between the phosphorylation level of Nrf2 and AKT was also analyzed by using Wortmannin and insulin, and the results confirmed that the two parties correlated to each other positively, for the correlation coefficient r was 0.86 and 0.93 in A549 and H460 cell lines respectively. At last, A549Nrf2- and h460Nrf2-cell lines became more sensitive to the attack of PBMCs than that of their wild type owing to Nrf2-deficiency, for increased apoptosis was observed in co-culture experiment. Conclusion:PI3K/AKT pathway plays a vital role in regulating PD-L1 expression in A549 and H460 cell lines, and this action is potentially realized via phosphorylating Nrf2.
［Key words］ Immune surveillance; PD-L1; Lung carcinoma
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流式细胞术分析的FITC标记PD-L1由本实验室自行偶联；蛋白质印迹法（Western blot）所用试剂购自美国Bio-Rad Laboratories公司。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR），使用的Quant One Step RTFQ-PCR kit检测试剂盒及反转录试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；ROS探针检测试剂盒购自美国AAT Bioquest公司，用于检测PD-L1转录水平的RTFQ-PCR引物购自美国Thermofish公司；Dual-Luciferiase Reporter Assay System购自美国Promega公司；FuGENE［sup］®［/sup］6转染试剂盒购自美国Promega公司；SYBR green染料购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Dy-nabeads®人CD3/CD28 T细胞激动剂购自美国Life Technology公司。
报告基因及细胞ROS反应检测采用美国PE 公司生产的EnVision多功能酶标仪，RTFQ-PCR 检测仪器为美国ABI公司的Stepone plus型RT-FQ-PCR仪，Western blot定量分析软件为Image J 2.0。
1.2 转录因子敲除细胞株构建
A549细胞和H460细胞分别以3×106个/mL接种于含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养24 h后更换为不含血清的RPMI-1640培养基继续培养2~3 h。取3 μL浓度为 0.1 μg/μL的FuGENE［sup］®［/sup］6加入到的97 μL无血清培养基轻轻混匀，于室温下静置5min，加入 2 μL 浓度为1 μ
g/μL的shRNA-plamid（用于HEB、HTF4、Nrf2及FOXO3a等转录因子敲除）到试管中，用移液器混匀，室温放置20 min。用100 μL 吸出转染液，均匀的滴入含10%灭活胎牛血清RPMI-1640的培养皿中，于CO2培养箱中培养6~ 8 h，待后续实验检测。
1.3 PD-L1基因的luciferin双报告基因体系构建 据美国国家生物技术信息中心（NCBI，National Center for Biotechnology Information）基因数据库查验设计引物。顺义链为5’-TCAC-CGAAGGTCAGAAAGTCCAACGC-3’，反义链为5’-GGAGCCTCGGGGAAGCTGCG-CAGAACTG-3’。通过PCR扩增方法获得PD-L1基因启动子，并与pGL3-basic载体进行连接后转化入大肠杆菌中扩增，挑选菌落PCR为阳性克隆送测序。构建成功后，表达载体与海肾荧光素酶基因以1 000∶1的比例共转染A549细胞和H460细胞，同时以pGL3-basic空载体作为对照。转染 48 h后，使用Promega的Dual-luciferase报告基因检测试剂盒验证PD-L1启动子活性。
1.4 PD-L1的转录水平检测
根据mRNA提取试剂盒说明，提取A549细胞总RNA，并使用反转录试剂盒获得cDNA 文库。据NCBI基因数据库查验，设计PCR引物。顺义链为5’-TGTACCACGTCT CCCA-CATAACAG-3’，反义链为5’-ACCCCACGATG AGGAACAAA-3’。以β-actin为内参，顺义链为5’-TGCTGACAGGATGCAGAAGGA-3’；5’-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3’。对RTF Q-PCR实验数据采用2-△△Ct法进行分析。
1.5 Western blot检测
分别收集实验组和对照组细胞，加入事先预冷至4 ℃的洗板裂解液［（裂解液：50 mmol/L Tris，pH为7.4；150 mmol/L NaCl溶液；1% Triton X-100；1.0%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），以及10 mmol/L 的PMSF，10 mmol/L氟化钠］， 10 mmol/L EDTA，0.1%的亮抑蛋白酶肽）5~10 min 后收集于1.5 mL离心管中，冰浴超声裂解细胞。将裂解液于4 ℃、11 000×g离心10 min，取上清液测定蛋白质浓度，调整各组蛋白浓度一致后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。将电泳后的SDS-PAGE胶经过100 V电转1 h至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，将膜置于5% BSA室温封闭1 h，一抗（体积比1∶8 000 稀释）室温温育 2 h，TBST洗涤3次，每次10 min。二抗（体积比1∶10 000稀释）室温温育1 h，用TBST洗涤。最后PVDF膜用增强型化学发光剂（ECL）溶液浸润，显影观察。
1.6 PBMC细胞与肿瘤细胞共培养
将A549细胞与H460细胞及其对应的人工构建基因缺陷株以每孔6×103个肿瘤细胞的量接
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种，并培养于10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养于CO 2体积分数为5%、37 ℃的条件下。待细胞增殖16~18 h 后，去掉细胞上清液，加入适量的Lonza X-VIVO™ 15无血清细胞培养基继续培养48 h 后加入适量的PBMC 细胞共培养2 h 。按说明书要求加入适量的免疫因子刺激剂CD3和CD28单抗刺激剂，通过流式细胞术检测免疫细胞对A549细胞、H460细胞及其基因缺陷株的杀伤效应。
流式细胞术检测方法：待检测细胞经胰酶消化后，在2 000×g 的离心力下离心分离 3 min ，使用预冷的PBS 重悬细胞。加入FITC 标记 Annexin-Ⅴ及PI ，轻轻混匀，与4 ℃冰箱中避光温育60 min 。温育完成后，在2 000×g 的离心力下离心分离3 min 弃去上清液，加入一定量PBS 洗涤并继续离心，重复洗涤3遍后上机检测。1.7 统计学处理
数据处理运用SPSS 20.0软件，采用t 检验方法，实验结果用x±s 表示。方差齐性者采用方差分析法进行分析，方差不齐者进行秩变换后具备方差齐性，然后进行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。组间数据相关性分析采用Pearson 相关系数，并
在显著性水平为0.05区间内进行双尾检验。
2 结 果
2.1 Insulin调节A549及H460细胞内PD-L1的表达水平
首先检测insulin 的刺激对A549及H460亲本细胞内P D -L 1的影响。结果显示，细胞经 10 μg/mL 的insulin 刺激后，两株细胞内AKT 的磷酸化水平出现显著增加，伴随着PD-L 1基因的转录（图1A 、B ）和表达水平（图1C 、D ）较阴性对照组而言，也出现显著的增强。接着，我们继续检测了在敲除特定转录因子的缺陷株中，insulin 是否仍然能保持着对PD-L 1表达的刺激效应。结果如图1A 、图1B 显示，相同剂量的 insulin ，对A549HEB-、H460HEB-、A549HTF4-、H 460H T F 4-、A 549F O X O 3a -及H 460F O X O 3a -细胞中PD-L 1的转录水平影响显著（P <0.001），但在 A549Nrf2-、H460Nrf2-两株细胞株中PD-L 1在刺激前后转录水平无明显变化（P>0.05）。另外，Nrf 2敲除后与亲本株比较，的A549Nrf2-、H460Nrf2-细胞株中PD-L 1的表达水平的变化和转录水平变化完全一致（P >0.05，图1C 、D
）。
图 1 Insulin对A549、H460细胞亲本株和转录因子缺陷株中PD-L 1的转录和表达的调节作用
Fig. 1 Insulin regulated the transcription and expression of PD-L1 in A549 and H460 cell lines and their transcription factor -deficient strain A: Digital alignment result of AKT phosphorylation and PD -L 1 transcription in A549 cell line and its transcription factor -deficient strain; B: Digital alignment result of AKT phosphorylation and PD -L 1 transcription in H460 cell line and its transcription factor -deficient strain; C: Digital alignment result of AKT phosphorylation and PD -L 1 expression in A549 cell line and its transcription factor -deficient strain; D: Digital alignment result of AKT phosphorylation and PD -L 1 expression in H460 cell line and its transcription factor -deficient strain
王 静，等 PI3K/AKT通路通过Nrf2途径调控PD-L1在非小细胞肺癌中的表达
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2.2 ROS反应经Nrf 2调节PD-L 1的转录与表达 我们发现，A K T 的激活可以显著地提高PD-L 1在A549细胞和H460细胞内PD-L1蛋白的转录和表达水平，且这种促进作用与转录因子Nrf 2有着重要的联系。为进一步验证Nrf 2在PD-L 1表达中的作用，我们使用ROS 诱导法
pgl3
来破坏细胞中Keap 与Nrf 2的结合，促进Nrf 2入细胞核发挥作用。结果显示，两株细胞株对 isoproterenol 的刺激，均表明出了PD-L1增量表达的效应，且呈浓度依赖性（图2）。
Isoproterenol 提高PD-L1表达的作用，可以被ROS 清除剂NAC 解除（图3
）。
图 2 Isoproterenol通过ROS途径上调A549细胞及H460细胞内PD-L 1的转录和表达水平
Fig. 2 Isoproterenol up-regulates the transcription and expression of PD-L 1 via ROS pathway in A549 and H460 cell lines
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