.论著.
李俊龙1刘小康2王祎
!.第三军医大第一附属医院西南医院研究中心，重庆404100；
2.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都610041)
摘要目的：构建含有野生型或突变型人三叶因子1(Trefoil factor1,TFF1)基因启动子双荧光素酶报告
基因重组质粒，并研究雌激素对上述启动子转录活性的影响。方法：设计人野生型和突变型TFF1基因启动子的 引物，扩增回收片段，将其克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组质粒，经双酶切和测序鉴
定后转染胆囊癌GBC-SD细胞,24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果： 成功
构建了野生型pGL3-TFF1质粒和雌激素应答元件(Estrogen response elements,ERE)位点突变的pGL3-TFF1-
△ERE突变质粒，激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)位点突变的pGL3-TFF1-#AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-#ERE+△AP1双突变质粒。经双荧光素酶报告基因检测分析，pGL3-TFF1质粒和pGL3-TFF1-#ERE
突变质粒均具有基础转录活性，与对照组比较(P<0.001)。雌激素能进一步增强野生型TFF1启动子质粒和pGL3-TFF1-#ERE突变质粒的启动子转录活性(P<0.01)，而对pGL3-TFF1-#AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-
△ERE十#AP1双突变质粒的活性无影响(P>0.05)。结论：本研究成功构建了野生型以及突变型TFF1启动子
质粒，发现非经典雌激素受体结合部位—
—激活蛋白KAP-1)位点对雌激素诱导的TFF1启动子转录活性增强发
挥决定性作用。
关键词：抑癌基因;TFF1；启动子质粒
三叶因子1(Trefoil factor1,TFF1)是三叶因
子家族蛋白之一，又称为雌激素诱导蛋白，首先在雌
激素受体表达阳性的人乳腺癌细胞MCF-7中发现,
是典型的雌激素应答基因TFF1在胃肠道粘膜
屏障和修复中发挥重要作用，包括细胞的迁移、分化、血管生成等23)。在胃癌细胞中，TFF1通过上
调细胞周期依赖性激酶的水平，延迟细胞的周期进程，抑制细胞凋亡(，5)。并且也有研究表明在胃癌
的发生发展过程中,TFF1通过下调miR504的水平
激活P53基因的表达，从而发挥抗肿瘤作用6。总之，目前对于TFF1在不同肿瘤中发挥的作用及其
作用机制存在争议的。而另一方面，近年来有学者
胆囊癌患者的原发性肿瘤组织中发现了雌激素受体ER以及孕激素受体PR的大量表达，并且通过免疫
组化检测到了TFF1的阳性表达，提示TFF1在胆
囊癌的发生发展过程中具有重要作用7*因此本研
究构建了含有人TFF1基因野生型启动子质粒和突
变型质粒的荧光素酶报告基因载体，并研究了雌激
作者简介：李俊龙，男，硕士研究生，主要从事药理学研究，Email：137046069@qq；
△通讯作者：王祎，男，副教授，主要从事天然免疫研究，Email：in。素对TFF1启动子转录活性的影响，为寻TFF1基因的核心启动子序列，进一步研究TFF1基因的转录调控机制提供基础*
1材料与方法
1.1试剂与细胞
胆囊癌细胞GBC-SD细胞株购自中国科学院科学究院化学与细胞学究
细胞库、大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5$购自日本Takara公司；定向诱变试剂盒购自美国Strata-gene
公司；载体质粒pGL3-Basic质粒以及内参质粒pRLSV40质粒和双荧光素酶检测试剂盒均购自美国Promega公司；转染脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒购自美国Omega公司。
1.2方法
1.2.1构建人野生型及突变型TFF1基因启动子荧光素酶报告基因载体
根据NCBI数据库中人TFF1基因序列(登录号:AB038162.1)，选取TFF1基因CDS区前一568位至一2位核昔酸作为启动子序列，其中包含经典
的雌激素应答元件(Estrogen response elements, ERE)序列和非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)结合位点* 5'端加入KpnI酶切位点，在3'端加入Hind III 切位点，基因合成：GGTACC(KnpI) GATTACAGGCGTGAGCCACTGCGCCAGGC-CTACAATTTCATTATTAAAACAATTCCAC TGTAAAAGAATTAGCTTAGGCCTAGACG GAATGGGCTTCATGAGCTCCTTCCCTTCC CCCTGCAAGGTCACGGTAGGCC(ERE)AC-CCCGTGAGCCACTGTTGTCACGGCCAAGCC TTTTTCCGGCCATCTCTCACTATGAATCA (AP-1)CTTCTGCAGTGAGTACAGTATTTACC CTGGCGGGAGGGCCTCTCAGATATGAGTAG GACCTGGATTAAGGTCAGGTTGGAGGAGAC TCCCATGGGAAAGAGGGACTTTCTGAATCT CAG
ATCCCTCAGCCAAGATGACCTCACCA CATGTCGTCTCTGTCTATCAGCAAATCCTT CCATGTAGCTTGACCATGTCTAGGAAACAC CTTTGATAAAAATCAGTGGAGATTATTGTC TCAGAGGATCCCCGGGCCTCCTTAGGCAAA TGTTATCTAACGCTCTTTAAGCAAACAGAG CCTGCCCTATAAAATCCGGGGCTCGGGCG GCCTCTCATCCCTGACTCGGGGTCGCCTTT GGAGCAGAGAGGAGGCAAGCTT(Hind))*另外使用DNASTART软件，分别设计ERE位点和AP-1位点的TFF1，启动子由苏州金唯智公司合成*将目的片段pGL3-Basic载体上，于16°C连接过夜，次日将产物转化E.coii DH5a感受态细胞，接种于含Amp的LB固体培养皿,37C倒置培养过夜。分别单克，接种于LB液体培养基，扌切鉴定，并送苏州金唯智公司进行测定*
1.2.2子荧光鉴定
胆囊癌细胞GBC-SD细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中。将2X105个细胞接种于24孔板中，于37C、5%CO2培养箱中培养过夜*细胞处理分为空白对照组(转染pGL3-Basic.)，实验组(转染野生型或突变型重组质粒)
*当细胞达
70—80%融合度时，参照Lipo2000转染试>明，每孔中的比例为DNA：Lipo=0.5'g：2'L，将构建基因与相应的内参基因pRL-SV40按照9：1的共转染细胞*24h后细胞，按照双酶检测试测定各组的相对荧
光素酶活性
*
1.2.3统计学处理
据以均数士(X±SD)表示，采用GraphPadPrism6软单因素方差3
P<0.05表示有显著性，具有学*
2结果
2.1TFF1启动子荧光素酶报告基因载体双酶切鉴定结果
建的pGL3-TFF1，pGL3-TFF1-△ERE,pGL3-TFF1-#AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-#ERE+#AP-1双突
Kpn I和Hindlll进行双酶切鉴定，酶切电泳约1.2kb小片段和4.lkb目的片段的大片段，与插入的TFF1启动子目的片段和线性pGL3-Basic大小相符合，见图1*
A B C D
图1双酶切鉴定启动子荧光素酶报告基因
注：1：undigested；2:digested with Kpn IHindl H；3:DNA Marker；
A：pGL3-TFF1,B:pGL3-TFF1-#ERE，C:pGL3-TFF1-#AP-1，D：pGL3-TFF1-△ERE+#AP-1质粒双酶切定*
2.2野生型及突变型TFF1基因启动子质粒测序鉴定结果
PGL3-TFF1质粒,pGL3-TFF1-#ERE突变质粒，pGL3-TFF1-#AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-#ERE+#AP-1DNA测序由苏州金唯公司完成，测与本实验中设列相比较，一致，证建成功，示意图见图2*
2.3生TFF1基因
将构建的4种启动子别与内「粒PRLSV40共转染人胆囊癌细胞GBC-SD细胞后，测和活性，并将两者的比值作为该启动子的相对活性*结果如图3A所示，与pGL3-Basic组相比较，pGL3
-
TFF1的基础转录活性升高了约2.20倍,pGL3-TFF-AERE的转录活性升高约了 1.5倍,pGL3-TFF1-△AP-
1的转录活性升高了0.076倍‘pGLB-TFF-AERE十△AP1双突变的转录活性升高了0.056倍。表明AP1结合位点的TFF1基因启动子的转录活性具有关键作用*
图2野生型及突变型TFF1基因启动子的荧光素酶报告载体示鳶图
为了进一步检验雌激素与TFF1蛋白表达的关系，我们将各启动子别转人胆囊癌细胞GBC-SD细胞后，给与10—9mol•L-1外源性雌激素刺激24h，后测定各组荧光强度。实验图3B 示，与无雌激理组比较，雌激显著升高野型pGL3-TFF1质粒和型pGL3-TFF1-△ERE质粒的转录活性(P<0.001*但对pGL3-TFF1-△AP1突变质粒和pGL3-TFF-AERE十△AP-1的转录活性影响不大。
A B
图3双荧光素酶报告基因检测启动子转录活性注:A：启动子突变对TFF1转录活性的影响.双荧光素酶报告基因检测系统检测构建的启动子质粒的基础转录活性，与空白对照组比较，***
P<0.001.B：唯激素对胆囊癌TFF1表达的影响*E2代表该组经唯激素处理,pGL3Sasi-uc为空载质粒.唯激素刺激组与无唯激素刺激组相比较,TFF1转录活性显著升高，*** P<0.001与唯激素刺激的野生型TFF1启动子组相比较,AP1位点突变e及双位点突变组TFF1转录活性极显著性降低，(((P<0.001.
3讨论
叶因子家族是一类小分子调节肽，包括3个成员TFF1、TFF2、TFF3。其中TFF1又称为雌激
蛋白，是经典的雌激素应答*正常情况主胃体和胃窦皮表达()*目前研究认为TFF1的表达种展的重
理学基础，如TFF1表达缺起胃性损伤9。在正常的胆囊组织中无TFF1的表达，但在囊炎、不典型以及胆囊癌出现时大量表达* Kornprat：究中也证实了这一点，其研究指出TFF1在正中不表达，上皮细胞出现炎症改变时开始表达，并且在35%的原位癌以及24%的转移组织中检测到TFF1的免疫反应性，且着与的增加，TFF1的免疫反应性显著降低的，这TFF1囊结石、胆囊炎和胆囊癌之种缺失的联系(0)*但目前胆囊中TFF1蛋白表达的调控机制仍未有，雌激以及雌激素受体在胆囊展过程中的作用机制也未阐明*
本实验成建了野生型和突变型TFF1基因启动子，并通过瞬时转染将其成功转了胆囊癌细胞GBC-SD*根据上述的实验，我们ERE位点和AP1位点同与了胆囊癌中TFF1的调控，但ERE作为雌激素的应答元件，囊癌中的有限的，TFF1的表达调控更的是AP1结合位点*囊组织作为一性激素靶器官，其ER的表达存在一定限制，这限制ERE位点控作的一*本研究为将入了囊病机理，及展过程提供一定的理论依据*
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(收稿日期=2019-7-18)
Construction and characterization
of pGL3-TFF1-promoter dual luciferase reporter plasmid
Li Jun-lon g1,Liu Xiao-kang2,Wang-Yi2#
pgl3(1.Researchserviceo f ice"theFirstA f iliatedSouthwestHospital"
Third Military Medical University,Chongqing404100；
2.DepartmentofPharmacology"WestChinaSchoolofPreclinical
andForensicMedicine"SichuanUniversity"SichuanChengdu610041)
Abstract Objective:To construct the luciferase reporter gene vector containing wild type or mutant human TFF1gene promoter,and measure the transcription activity of the promoter.Methods:We designed primers for TFF1gene promoter,and obtained the primers for mutant TFF1promoter using directed mutagenesis kit.Subsequently,we cloned into pGL3-Basic plas-m/dtoconstructlucferasereportervectorsofTFF1gene.Wetransfectedthevectors/ntotheGBC-SDce l safterbe/ngverfed by double enzyme digestion and DNA sequencing.Luciferase expression activity was detected by double luciferase reporter gene detection system24h later.Results:The wild type pGL3-TFF1promoter and three mutant TFF1promoter reporter vectors were successfully constructed.The dual luciferase reporter assay showed that pGL3-TFF1and pGL3-TFF1-#ERE plas
mid had promoter activity.Estrogen could induce the transcription activity of pGL3-TFF1and pGL3-TFF1-#ERE(P<0.01),but with few effects on the activity of pGL3-TFF1-△A P-1and pGL3-TFF1-#ERE+#AP-1plasmid.Conclusion:All of the luciferase reportergenevectorscontainingwidtypeormutantTFF1promoterregionaresuccessfu4yconstructed.TheAP-1bindingsite-plays a key role in the activity of TFF1promoter,not that of ERE binding site.
Key Words：Anti-oncogene；TFF1；Promoter plasmid
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