本技术涉及一种鲟鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加NaCl，NaEDTA和PMSF混合液均质匀浆搅拌，离心分离，沉淀物加硫酸提取，低温离心分离，滤液用NaOH调pH，透析除盐后用乙醇沉淀，用丙酮和乙醚洗，真空冷冻干燥得鲟鱼粗蛋白；经过纯化，得鲟鱼精蛋白。鲟鱼精蛋白用磷酸盐缓冲液匀浆，加酶，γ射线辐照，酶解得酶解液；酶解液沸水灭酶，冷却，加三溶液，离心分离，真空冷冻干燥得鲟鱼精蛋白多肽。本技术原材料丰富，天然无污染，制备的鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽具有高持水保水性，抑菌效果，可广泛用于食品、化妆品、药品领域；特别可作为抗肝素剂用于体外心脏手术中。 技术要求
1.一种鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
1）取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14 mol/L NaCl，0.05 mol/L NaEDTA和0.001 mol/L PMSF的混合溶液，均质匀浆搅拌1 min，于0℃搅拌20 min，静置10 min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3
次，得沉淀物；
2）取步骤1）所得沉淀物按体积比1：6加入浓度为0.8 mol/L的硫酸溶液，温度35℃，提取30 min，在0℃低温离心10 min，过滤，取滤液后的滤渣再重复用上述浓度的硫酸溶液提取4次，合并滤液；
3）取步骤2）所得滤液用NaOH调节pH至7.0，透析除盐后用其体积三倍的95%冷乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醚各洗2次，真空冷冻干燥24 h，得鲟鱼粗蛋白；
所述真空冷冻干燥条件为温度-50℃，压力10 Pa；
4）将步骤3）所得鲟鱼粗蛋白经过两步纯化，得鲟鱼精蛋白；
所述两步纯化为Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析和CM Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化；
每步分离纯化前都加入0. 5 mol/L NaEDTA和0. 1 mol/L PMSF的混合溶液；
步骤4）所得鲟鱼精蛋白，分子量为10.8ku，赖氨酸、组氨酸和精氨酸三种碱性氨基酸含量达57.4%，占氨基酸总量的81.1%；所述鲟鱼精蛋白结构中主要为无规则卷曲结构，无规则卷曲构象占64.70%，α-螺旋占7.05%，β-折叠15.55%，β-转角15.55%；所述鲟鱼精蛋白具有高结合水能力，其吸水率达
88.8±0.13%，持水力达75.7±0.08%；
鲟鱼精蛋白相变温度可达92.5℃；
5）将步骤4）所得鲟鱼精蛋白以体积比1:30加入pH为7的磷酸盐缓冲液匀浆，得鲟鱼精蛋白溶液；
6）将步骤5）所得鲟鱼精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其体积3%的木瓜蛋白酶，然后置
于60Co辐照场中通过γ射线辐照，取出后在60℃水浴中加热酶解8 h，得酶解液；
所述60Co辐照场中通过γ射线辐照的辐照方法为：透明玻璃杯距地面高40 cm，距离60Co辐照源1.4 m，辐照剂量率为33 Gy/min，辐照时间120 min，辐照不均匀度小于1.0，辐照环境温度18℃；
7）取步骤6）所得酶解液，沸水灭酶10 min，冷却；加入与酶解液等体积的，百分浓度为20%的三溶液，于0℃下离心15 min，取上清液，真空冷冻干燥24 h，即得鲟鱼精蛋白多肽；
所述真空冷冻干燥条件温度-50℃，压力10 Pa；
步骤7）所得鲟鱼精蛋白多肽含有分子量为1.6ku，3.4ku和9.3ku的三种多肽组分；所得鲟鱼精蛋白多肽吸水率达106.0±0.09%，持水率为81.3±0.05%；
所述鲟鱼精蛋白多肽对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、酵母菌和黄曲霉均有抑制作用；
所述鲟鱼精蛋白多肽清除超氧阴离子自由基活性为：分子量为1.6ku的鲟鱼精蛋白多肽的O2-•清除活性的IC50值为0.9 mg/mL，分子量为3.4ku的鲟鱼精蛋白多肽的O2-•清除活性的IC50值为3.5 mg/mL，分子量为9.3ku的鲟鱼精蛋白多肽的O2-•清除活性的IC50值为16.43mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，其特征在于：步骤4）中的Sephadex G-50葡萄糖凝胶层析条件为：紫外检测波长220 nm，恒流泵流速480 mL/h，上样3~4 mL，每3 min收集1试管，将收集到的紫外吸收峰内的溶液合并，旋蒸浓缩；CM SepharoseFast Flow离子交换层析的条件为：紫外检测波长为220 nm，将上一步纯化的有效组分，每次以4~6 mL的量上样，1 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，每3 min收集1试管，最后合并有效组分，鉴定后乙醇沉淀分离，于-50℃，压力10 Pa下冷冻干燥24 h，得精鱼精蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，其特征在于：其中步骤7）中还包括鲟鱼精蛋白多肽的分离过程，分离过程为：经截流分子量为10ku、5ku、3ku、2ku的超滤膜分离后，得到了5ku-10ku、3ku-5ku、和小于2ku的3个分子量段的组分；条件为：将步骤6）所得的鲟鱼精蛋白酶解液，沸水灭酶10 min后，冷却；加入与酶解液等体积的，百分浓度为20%的三溶液，于0℃下离心15 min，取上清液，制得鲟鱼精蛋白多肽溶液；将制得的鲟鱼精蛋白多肽溶液过截留分子量为10000u的超滤管，将其透过液过截留分子量为5000u的超滤管，然后将其透过液过截留分子量为3000u的超滤管，再将其透过液过截留分子量为2000u的超滤管收集各个分子量段的鲟鱼精蛋白多肽液，-50℃，压力10 Pa下冷冻干燥24 h，后保存。
4.根据权利要求1所述的一种鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，其特征在于：步骤1）所取鲟鱼白为来自成熟的鲟鱼-甲骨板，其精巢组织发育至第Ⅴ期。
5.根据权利要求1所述的一种鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，其特征在于：步骤2）中离心分离转速为4000 r/min；步骤7）离心分离转速为5000 r/min。
技术说明书
一种鲟鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽的制备方法
技术领域
本技术涉及蛋白及蛋白多肽领域，具体涉及一种鲟鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽的制备方法。
背景技术
鱼精蛋白是一种多聚阳离子肽，主要存在于各类动物成熟的精巢组织中，与DNA紧密结合在一起。鱼精蛋白具有较强的抑菌特性，在食品中主要用作防腐剂。与一般的化学合成防腐剂相比，鱼精蛋白具有许多优点，如安全性高、防腐性能好、热稳定性好等。而且，作为精氨酸含量丰富的蛋白类物质，鱼精蛋白具有很高的营养性和功能性，因此在食品应用研究范围广泛。鱼精蛋白也可与肝素的葡萄糖胺聚糖结合，是唯一与肝素形成拮抗作用的药物，可以快速有效地抵抗肝素或人工合成的抗凝血剂的抗凝作用，其在心脏直视手术和心导管介入中有较大应用。鱼精蛋白多肽是鱼精蛋白的酶解产物，具有更小的分子量和异源性，可显著降低机体过敏风险，有效解决鱼精蛋白直接作用与机体时产
生的过敏反应、免疫反应甚至休克的突发风险，使鱼精蛋白的应用更安全放心。而相比于鱼精蛋白，鱼精蛋白多肽具有更好的抑菌性，吸水持水性。通过辐照辅助酶解，得到更小分子量的天然活性蛋白肽类，具有高溶解性，高功能性等优点，有广阔的应用前景。
目前，市场上的鱼精蛋白主要提取自鲱、鲑科鱼等海水鱼，而且得率较低，而我国这类海鱼资源缺乏。鲟鱼具有高营养价值，蛋白含量高，而鲟鱼养殖业产量大，废弃物精巢组织原料充足。鱼类精巢除作为养鱼饲料及一部分腌制食品利用外，其它用途很少，价值低。如果从中分离出鱼精蛋白，利用蛋白酶抑制剂提高其提取得率，并在适当的领域应用则有望提高其附加价值，同时减少资源浪费和环境污染。
技术内容
本技术的目的是针对等问题，旨在提供一种原材料丰富，天然无污染，抑菌性能强，且具有高持水保水性和抗氧化性；分子量小的鲟鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽的制备方法。
本技术目的的实现方式为，一种鲟鱼精蛋白的制备方法，具体步骤如下：
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/L NaCl，0.05mol/L NaEDTA和0.001mol/L PMSF的混合溶液，均质匀浆搅拌1～3min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；
2)取步骤1)所得沉淀物按体积比1：5～1：8加入浓度为0.8mol/L～1.2mol/L的硫酸溶液，温度25～65℃，提取15min～60min，在0℃低温离心10min，过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取2～6次，合并滤液；3)取步骤2)所得滤液用NaOH调节pH至7.0，透析除盐后用其体积三倍的95％冷乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醚各洗2次，真空冷冻干燥24h，得鲟鱼粗蛋白；
所述真空冷冻干燥条件为温度-50℃，压力10Pa；
4)将步骤3)所得鲟鱼粗蛋白经过两步纯化，得鲟鱼精蛋白；
所述两步纯化为Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析和CM Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化；
每步分离纯化前都加入0.5mol/L NaEDTA和0.1mol/L PMSF的混合溶液；
步骤4)所得鲟鱼精蛋白，分子量为10.8ku，属于三鱼精蛋白，赖氨酸、组氨酸和精氨酸三种碱性氨基酸含量达57.4％，占氨基酸总量的81.1％；所述鲟鱼精蛋白结构中主要为无规则卷曲结构，无规则卷曲构象占64.70％，α-螺旋占7.05％，β-折叠15.55％，β-转角15.55％；所述鲟鱼精蛋白具有高结合水能力，其吸水率达88.8±0.13％，持水力达75.7±0.08％；
鲟鱼精蛋白相变温度可达92.5℃。
一种鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，具体步骤如下，
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/L NaCl，0.05mol/L NaEDTA和0.001mol/L PMSF的混合溶液，均质匀浆搅拌1～3min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；
2)取步骤1)所得沉淀物按体积比1：6加入浓度为0.8mol/L～1.2mol/L的硫酸溶液，温度35℃，提取30min，在0℃低温离心10min，过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取4次，合并滤液；
3)取步骤2)所得滤液用NaOH调节pH至7.0，透析除盐后用其体积三倍的95％冷乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醚各洗2次，真空冷冻干燥24h，得鲟鱼粗蛋白；
所述真空冷冻干燥条件为温度-50℃，压力10Pa；
4)将步骤3)所得鲟鱼粗蛋白经过两步纯化，得鲟鱼精蛋白；
所述两步纯化为Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析和CM Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化；
每步分离纯化前都加入0.5mol/L NaEDTA和0.1mol/L PMSF的混合溶液；
步骤4)所得鲟鱼精蛋白，分子量为10.8ku，属于三鱼精蛋白，赖氨酸、组氨酸和精氨酸三种碱性氨基酸含量达57.4％，占氨基酸总量的81.1％；所述鲟鱼精蛋白结构中主要为无规则卷曲结构，无规则卷
曲构象占64.70％，α-螺旋占7.05％，β-折叠15.55％，β-转角15.55％；所述鲟鱼精蛋白具有高结合水能力，其吸水率达88.8±0.13％，持水力达75.7±0.08％；
鲟鱼精蛋白相变温度可达92.5℃；
5)将步骤4)所得鲟鱼精蛋白以体积比1:30～1:50加入pH为6～8的磷酸盐缓冲液匀浆，得鲟鱼精蛋白溶液；蛋白精
6)将步骤5)所得鲟鱼精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其体积的3％～8％木瓜蛋白酶，然后置
于60Co辐照场中通过γ射线辐照，取出后在50～60℃水浴中加热酶解6～9h，得酶解液；
所述60Co辐照场中通过γ射线辐照的辐照方法为：透明玻璃杯距地面高40cm，距离60Co辐照源1.4m，辐照剂量率为33Gy/min，辐照时间120min，辐照不均匀度小于1.0，辐照环境温度18℃；
7)取步骤6)所得酶解液，沸水灭酶10min，冷却；加入与酶解液等体积的，百分浓度为20％的三溶液，于0℃下离心15min，取上清液，真空冷冻干燥24h，即得鲟鱼精蛋白多肽；
所述真空冷冻干燥条件温度-50℃，压力10Pa。
本技术原材料丰富，天然无污染，所制备的鲟鱼精蛋白属于体外异源性物质，可解决临床上依然存在的鱼精蛋白产生过敏反应、免疫反应甚至休克的突发风险；容易不被机体识别导致过敏反应，热稳定性高，相变温度可达92.5℃。鱼精蛋白经酶解后得到的鲟鱼精蛋白有更小的分子量和异源性，可大大降低过敏风险；具有高持水保水性，吸水率达106.0±0.09％，持水率为81.3±0.05％；且对大肠杆菌、金黄葡萄糖球菌、酵母菌和黄曲霉都有较好的抑菌效果。
本技术制备的鱼精蛋白及鱼精蛋白多肽可广泛用于食品、化妆品、药品领域。特别可作为抗肝素剂用于体外心脏手术中。
附图说明
图1为DSC吸热峰图。
具体实施方式
本技术是除杂处理后的鱼白切碎成浆状，加NaCl，NaEDTA和PMSF混合液均质匀浆搅拌，离心分离，沉淀物加硫酸提取，低温离心分离，滤液用NaOH调pH，透析除盐后用乙醇沉淀，用丙酮和乙醚洗，真空冷冻干燥得鱼精粗蛋白；经过2步纯化，得精鱼精蛋白。鱼精蛋白用磷酸盐缓冲液匀浆，得鱼精蛋白溶液；加酶，γ射线辐照，酶解得酶解液；酶解液沸水灭酶，冷却。加三溶液，离心分离，真空冷冻干燥得鲟鱼精蛋白多肽。
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