ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ技术检测正常肾细胞株与肾癌细胞株的差异表达蛋白 摘要目的 分析体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株的蛋白质表达差异。方法 运用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片。两种细胞株均用IMAC3。震荡孵育5分钟。g．将蛋白芯片放入蛋白工作平台，每孔加入200μl缓冲液。剧烈震荡，室温孵育5分钟。h．弃去缓冲液，每孔立即加入50μl：2稀释于缓冲液中的样品，置于震荡器，室温孵育5分钟。b．重复上述操作一次。c．每孔中加入50μl 1:2稀释于缓冲液中的样品，剧烈震荡，孵育1小时。d．弃掉样品，每孔用200μl结合缓冲液洗涤2次，每次5分钟。e．弃去孔中液体，每孔加入200μl水洗涤，立刻甩干。f．从蛋白工作平台中取出蛋白芯片，空气中干燥。g．每孔加入0.5μlSPA，重复一次。h．干燥后用蛋白质飞行质谱仪进行质谱分析。细胞芯片
1．7数据采集和结果分析 蛋白质芯片采用PBSⅡC型读取数据，仪器用标准多肽校正，系统的质量偏差为0.1％。检测芯片时参数设置如下：激光强度210。检测敏感度10，优化分子质量范围为2000～10000Da，最高分子量为50000 Da，采用Cipher-gen proteinchip 3.1版本的分析软件自动采集数据，然后用Bio-marker Wizard软件分析样本细胞的蛋白质谱差异。两个蛋白峰比较时，差异蛋白定义为蛋白峰强度相差1倍以上。根据差异蛋白的分子量及等电点 和极小蛋白质无法鉴定的不足，进一步提高了蛋白质分离和坚定的速度。因此，已广泛应用于肿瘤细胞体外培养的研究中。其基本原理是根据蛋白质的荷质比的不同，利用将粗提物或样品加于芯片表面，使靶蛋白与探针分子结合，洗脱芯片表面，保留靶蛋白的芯片结合能量吸收分子(EAM)后，在真空管中用激光轰击，蛋白质在吸收能量后脱离芯片表面，由于其中加有一个正电荷，在电场中向阴极飞去，分子量大的飞行时间长，分子量小的飞行时间短，以此标记蛋白质的分子量，绘出蛋白质的图谱。在芯片阅读器一定强度的激光打击下，结合在芯片上的蛋白质发生电离和解吸附，不同质量的带电离子在通过电场时被加速，由于这些离子的质量电荷比不同，它们在真空场中飞行的时间长短不一致，记录仪通过检测飞行时间的长短，得出质量电荷比，信号由高速的模拟数字转化器转化记录并输入电脑，被测定的蛋白质以一系列峰的形式出现，绘制成质谱图，直接显示样本中各种蛋白质的分子量、含量等信息。SELDI-TOF-MS技术由蛋白质芯片系统和质谱仪两部分组成。其中，蛋白质芯片系统是SELDI-TOF-MS技术的核心和关键，其包括蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件。本研究采用WCX2和IMAC3两种蛋白芯片对肾癌细胞株和正常肾细胞株之间的差异蛋白进行分析，发现在WCX2芯片上差异蛋白的分子量均小于15000Da,说明WCX2芯片对分离低分子量蛋白质特别有效。同时，IMAC3芯片主要用于分析与金属结
合的蛋白或磷酸化蛋白，它可捕捉与镍、铜锌结合的蛋白，NAT构成活性位点，可以鏊合金属离子，待测蛋白通过组、、半胱和磷酸化氨基酸与鏊合金属结合，因此，其对有酶作用的功能性蛋白质的区分有良好的应用价值。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议