消化外科 2005年第4卷第4期265-267
Journal of Digestive Surgery,2005,4(4):265-267
文章编号:1671-4555(2005)04-0265-03・实验研究・组织芯片技术原位检测石蜡包埋肝细胞癌组织的研究吕文平 董家鸿 李晓武 【摘要】 目的 探讨组织芯片技术高通量原位免疫组织化学检测石蜡包埋肝细胞癌组织的价
值。方法 1991年1月-2002年6月西南肝胆医院实施根治性肝切除，病理证实为肝细胞癌234例
石蜡组织块，健康成人肝组织18例(西南医院肝胆外科研究所肝移植供肝组织)作为对照，重新包埋
石蜡组织，制备成为2个微阵列，分别为13×10(129点)和14×9(123点)，微阵列点直径1.0mm，点
间距为0.5mm。Envision法检测Vimentin和E2cadherin的表达。结果 组织芯片中组织样本的组
织学结构完整，可满足病理学实验要求。结论 组织芯片技术提供了一种快速、有效的组织学方法,
可广泛应用大样本肝细胞癌的免疫组织化学检测。
【关键词】 组织芯片 肝细胞癌 原位检测 高通量
【中图法分类号】 R446.8 【文献标识码】 A
I n situ studies of paraff in2embedded hepatocellular carcinom a tissue by tissue microarray technique
LüWenping,Dong J iahong,L i X iaow u.I nstit ute of Hepatobiliary S urgery,S outhwest Hos pital,
T hi rd Military Medical Universit y,Chongqing400038,China
【Abstract】 Objective To explore the application and values of paraffin2embedded hepatocellular
carcinoma(HCC)tissue microarray technique for high2throughput in situ immunohistochemical stud2
ies.Methods Paraffin2embedded tissue f rom234HCC and18healthy liver tissue samples f rom J anu2
ary1991to J une2002at Southwest Hospital were used for the microarray.Two TMA blocks were
constructed.129specimens were arrayed on one block and123on the other.Core tissue biop sies of
1.0mm in diameter were taken f rom caref ully selected morphologically representative regions of indi2
vidual paraffin2embedded samples(donor blocks)and precisely arrayed into a new recipient paraffin
block using a custom built instrument.Immunohistochemistry Vimentin and E2cadhenrin expression in
HCC was determined using immunohistochemistry technique.R esults The histological structure of
the specimens was complete in tissue microarray.It can meet the requirements of pathological experi2
ments.Conclusions Tissue microarray provides a rapid and powerf ul histological method that may be
used for high2throughput in situ studies and play an important role in tumor biology.
【K ey w ords】 tissue microarray hepatocellular carcinoma in situ studies
随着人类基因组计划的实施和初步完成，大量的生命遗传信息产生出来，这必然将对生物医学的研究方式以及医疗模式产生巨大的影响，医学研究的重心也逐渐从结构基因组学转移到功能基因组学，而利用结构基因组学提供的信息和材料研究基因功能已经成为后基因组学的主要任务。应用传统石蜡包埋或冰冻组织来进行大量的基因功能研究，不仅耗时而且浪费人力物力[1]，而组织芯片技术(tissue microarray,TMA)的出现为肿瘤研究提供了一个有力的工具[2,3]。 作者单位:400038第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是由肝细胞、血窦、血管等成分组成复杂组织，而组织芯片技术是将数十个至数百个小的组织片整齐的排在某一载体上(通常是载玻片)而成的微缩组织切片，如何既保障组织芯片对肿瘤的代表性又保障芯片的质量，是肝细胞癌组织芯片制备的关键问题，对此我们进行了初步研究，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1991年1月-2002年6月西南肝胆医院实施根治性肝切除，病理证实为肝细胞癌(HCC)234例石蜡组织块。
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男性214例，女性20例，男女比例10.7∶1，年龄11～80岁，平均48.73±11.41岁，发病至就诊时间为(94.24±14.56)d，中位存活时间为26.35月。健康成人肝组织18例(西南医院肝胆外科研究所肝移植供肝组织)作为对照。主要试剂和材料中DAB显液(北京中杉生物), Envision通用试剂盒(DA KO),Vimentin鼠源单抗隆抗体鼠(Santa Cruz),E2cadherin鼠源单克隆抗体(Santa Cruz),32氨丙基2乙氧基甲硅烷(APES)和多聚赖氨酸(PLL)均为博士德生物产品，石蜡(L EICA)，载玻片(FISH)，主要仪器中阵列仪(Beecher)，组织包埋机(M TA21)，切片机(L EICA)、烤片机(L EICA)。
1.2 方法
1.2.1 组织芯片的制备 (1)纳入研究的HCC234例病例，石蜡组织审核无误后按照病理编号排好顺序。
(2)在包埋机内65℃溶解石蜡组织块，制作供体蜡块。(3)切片后H E常规染，光学显微镜下观察，标记笔显微镜下标记取材部位(代表肿瘤大部分病理学特征且避免坏死区域)，同时在供体蜡块的相应部位予以标记。(4)将65℃的石蜡注入28.3mm×23.5mm×5.0mm包埋盒成型，制成受体蜡块(注意避免石蜡内可能产生的气泡)。
(5)将清洗干净的玻片硅化和PLL液挂胶，自然干燥, 4℃保存。(6)为保障组织芯片质量，将234例病例和18例健康肝组织，应用随机数字方法，随机分为2组，设计2个微阵列，分别为13×10(129点)和14×9(123点)，微阵列点直径1.0mm，点间距为0.5mm。(7)按照芯片制备仪流程制备组织芯片腊块，常规切片(厚度5μl)和捞片, 60℃烤片3min,58℃继续烤片18h,-20℃保存备用。
1.2.2 免疫组化染 采用Envision二步法。常规烤片、脱蜡,3%H2O2室温静置20min;PBS(0.01mol/L p H7.4)洗3次，在微波炉里加热0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液至沸腾后将组织芯片放入,10min,PBS洗3次；甩去多余血清，加一抗(1∶100)4℃过夜。在37℃复温45 min;PBS洗3次；滴加Envision二抗,37℃,30min;PBS 洗3次;DAB显，在显微镜下掌握染程度，自来水冲洗；苏木素淡染，盐酸酒精分化，脱水，透明，封片。
2 结果
2.1 组织芯片外观
芯片各点阵排列整齐，薄厚均匀，组织学结构完整，大多数组织点无皱褶、移位和裂开，点缺失率(含面积小于30%的点)为1.25%(见图1)。
2.2 形态学观察
光学显微镜观察H E染大组织切片与对应芯片点的形态学上无差异，与相应的病理号相符，在所有检查组织中，细胞核呈蓝，细胞质呈红。颜鲜艳，核浆对比清晰。细胞的形态结构显示清晰(见图2)。多处取材行组织大片H E染，与组织芯片对应点病理特点比较，发现芯片点组织可以代表肿瘤组织大部分的病理特点。
2.3 免疫组化染
Vimentin表达阳性主要定位于胞浆，而且几乎所有肿瘤间质内血管内皮细胞或淋巴细胞均强均着。E2cadherin主要定位于细胞膜，二者阳性表达均为棕黄着(见图3、4)
。
图1 芯片各点阵排列整齐，薄厚均匀，大多数
组织点无皱褶、
移位和裂开
图2 组织芯片HE染(×100)细胞的形态结
构显示清晰
图3 H CC组织Vimentin阳性表达(×100
E nvision法)
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・吕文平，等.组织芯片技术原位检测石蜡包埋肝细胞癌组织的研究
图4 H CC组织E2cadherin阳性表达(×100
E nvision法)
3 讨论
组织芯片在肿瘤的预后、演进以及分子表达等研究中具有重要的作用，通过对候选分子行大量组织标本的组织芯片检测，可以筛选到与肿瘤预后和演进相关的分子，并明确分子在肿瘤的表达部位[2,4]。
我们制备的组织芯片点缺失率很低，仅1.25%。我们防止点缺失主要体会有以下4点: (1)在制备过程中注意：受体蜡块打孔深度须一致；受体蜡块内应无气泡；供体组织取的长度要相同；微阵列蜡具制备完毕后应当适当加热后压平。以上措施可保障供体组织植入受体蜡块孔内深度一致，而在切片过程中减少点缺失率。(2)受体蜡块和供体蜡块石蜡品牌应当一致，本研究应用莱卡石蜡重新包埋供体组织。(3)组织芯片制备完毕后，应当放置于37℃恒温箱过夜，以增加组织与载玻片的粘合。(4)染过程应当动作轻柔、尽量减少在溶液中的浸泡时间，以防止在染过程中脱片。
组织芯片的构建和切片中所使用的石蜡，由于在打孔放组织块时要不断受到外力的冲击，蜡块存在易碎、裂开等问题，在切片时，不利于保持石蜡切片的完整性和连续性。因此，要切好一张完整并且能够连续的切片，必须对常规用的石蜡进行改进，组织芯片所用蜡必须做到即要有一定的硬度，又要有
一定韧性。本研究应用L EICA 蜡，在硬度和韧性方面均是较为理想的。有人研究在58℃的国产蜡加入2.5%左右的蜂蜡，并经过反复的加温和冷却，制成的蜡模与莱卡石蜡相似[5]。
此外，对于不同包埋情况的众多组织样本，应当尽量保障石蜡包埋条件一致性，这是防止组织芯片脱片、移位以及卷曲的关键问题，本研究对组织标本重新进行包埋，有效地避免了芯片的脱片、移位和卷曲等现象的发生。细胞芯片
取样标本能否代表肿瘤病理学和生物学特点是关系到研究结果可信度的关键问题，本研究制备完芯片后在光学显微镜观察H E染大组织切片与对应芯片点的上形态学无差异，肿瘤组织多处取材行大组织片H E染，与组织芯片对应的点比较，发现芯片点组织可以代表肿瘤组织大部分的病理特点。我们在标记取材部位时的原则是选取可代表肿瘤大部分区域病理特点的部位，避免坏死区域，尽量靠近与正常组织临近的肿瘤区域取材。
而且我们将234例HCC病例标本和18例健康肝组织随机分为2组，采用100～200个点的组织芯片，这样既可保证挖取的组织块能更全面的代表原组织结构的完整性，又能降低组织芯片制备的技术难度、保证组织芯片的质量，而且易于推广[6]。
参考文献
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[3]段光杰，阎晓初.组织芯片在消化道肿瘤病理研究中
的应用进展[J].消化外科,2004,3(4):
[4]段光杰，阎晓初，章容，等.应用组织芯片检测结直肠
腺瘤2腺癌β2连环蛋白的表达及其意义[J].第三军医
大学学报,2004,26(7):587-590
[5]倪灿荣，李芳梅，朱明华，等.提高组织芯片切片成功
率的方法和体会[J].中华病理学杂志,2002,31(6):
559-560
[6]杨军，苏宝山，王康敏，等.组织芯片研究领域中的几
个问题[J].中华病理学杂志,2002,31(6):556-558
(收稿日期:2005-03-16)
本文编辑：马正伟
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吕文平，等.组织芯片技术原位检测石蜡包埋肝细胞癌组织的研究
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