第58卷第6期 2021年6月
微
M 电子技术
Micronanoelectronic Technology
Vol. 58 No. 6
June 2021
DOI ： 10. 13250/j. cnki. wndz. 2021. 06. 006
吁子贤，林树靖，王菲，张笛，陈迪
(上海交通大学电子信息与电气工程学院，上海 200240)
摘要：胃癌细胞源外泌体作为生物标志物在胃癌早期检测中有着极大的应用潜力。但外泌体分离 难度大，这一问题极大地限制了外泌体的临床应用。为应对这一挑战，设计并制备了一款外泌体 磁分离微流控芯片。通过有限元仿真设计合理高效的微流控芯片结构，仿真结果证明设计的微过 滤器能改善微流控芯片内流体分布，从而有利于外泌体分离。通过微电子机械系统（MEMS) 工艺制备微流控芯片，利用扫描电子显微镜（S E M )表征芯片关键尺寸，证明制备的微流控芯 片尺寸精度可达1.5 M m 。通过免疫磁珠（I M N P )捕获外泌体，捕获效率可达60.2%，在微流 控芯片中完成外泌体的磁分离，实验结果证明微流控芯片外泌体分离纯度为76. 8%。 关键词：微电子机械系统（M E M S )；微流控芯片；微过滤器；免疫磁珠（I M N P )；外泌体分离 中图分类号：035; TH703
文献标识码：A 文章编号：1671-4776 (2021) ()6-〇496-()5
Abstract ： Exosomes derived from gastric cancer cells have great application potential as biomarkers for early detection of gastric cancer. However, it is difficult to separate exosomes ， and this limitation blocks the clinical application of exosomes. To meet this challenge, a microfluidic chip for magnetic separation of exosomes was designed and fabricated. A reasonable and efficient micr
ofluidic chip structure was designed through finite element simulation. The simulation results prove that the designed microfilter can improve the fluid distribution in the microfluidic chip, which is good for separating exosomes. The microfluidic chip was fabricated by micro-electromechanical system (MEMS) process, and the key dimensions of the microfluidic chip were characterized by the scanning electron microscopy (SEM). The results show that the size accuracy of the microfluidic chip can reach 1. 5 jim. The exosomes can be captured by immu- nomagnetic nano particles (IMNPs) , and the capture efficiency can reach 60. 2%. The magnetic separation of exosomes was completed in the microfluidic chip. The experimental results prove that the purity of the exosomes separated by microfluidic chips is 76. 8%.
收稿日期：2020-12-18
基金项目：国家然科学基金青年科学基金资助项目（82003274)通信作者：陈迪，E-mail: **************
Exosomes M agnetic Separation M icrofluidic Chip
Based on MEMS Technology
Yu Zixian, Lin Shujing, Wang Fei, Zhang Di, Chen Di
(School o f E lectronic In fo rm a tio n arid E lectrica l E n g in e e r in g ，
S h a n g h a i J ia o T o n g U niversity j S h a n g h a i 200240, C h ina )
4
%
吁子贤等：基于MEMS技术的外泌体磁分离微流控芯片
Keywords：micro-electromechanical system (M EM S)；microfluidic chip；microfilter；nomagnetic nano particle (IM NP)；exosome separation
PACC：0340G；07IOC
〇引言
早期诊断和及时对于胃癌具有重要意 义。当前现有的临床确诊技术主要是胃镜检查结合 病理学诊断。然而，这两种检测方法因其侵人性和 有创性并不适用于胃癌早期无症状的患者排除胃癌，从而导致患者错过最佳时间。并且用于癌 症早期诊断的生物标记物仍存在很大的局限性，例 如稳定
性差、特异性不高以及含量低等问题[〃3]。幸运的是，外泌体的发现为液体活检提供了新的可 能。癌细胞源外泌体包含许多与癌症相关的信息物 质，而且这些外泌体在外周血中可长期稳定的存在，因此，胃癌细胞源外泌体作为生物标志物在胃 癌的早期诊断中具有巨大的应用潜力。
要将胃癌细胞源外泌体应用于早期胃癌诊断，首先必须要将外泌体从体液中分离出来。但是外泌 体作为一种存在于成分复杂体液中的纳米囊泡（直 径为30〜150n m)，其分离难度巨大[4_5]。当前，传统的外泌体分离技术主要包括超速离心法、体积 排阻谱法、超滤法和基于免疫学分离法[4’6]。但 这些传统的外泌体分离技术都存在分离效率低和回 收率不高的问题，极大地限制了外泌体作为生物标 志物在胃癌早期检测领域的应用。
与这些技术相比，微流控芯片在外泌体分离领 域具有巨大的应用潜力，已经出现了许多用于癌细 胞源外泌体分离的微流控芯片[4’7—8]。基于外泌体 尺寸的微流控分离技术，主要是利用具有纳米孔或 纳米线的微流控装置实现外泌体分离。2012年，R.T.D avies等人[<)]设计了基于纳米孔膜的微流控
过滤系统从全血样本中分离外泌体的方法，通过小 鼠的动物实验证明了其分离外泌体的有效性。2018 年，J.K o等人[1°]提出了一种新型的磁性纳米孔捕 获技术从血浆中分离外泌体，并且在动物实验中检 测到了小鼠体内的早期胰腺癌。同年，武汉大学的 Z. C hen等人[”]通过将氧化锌纳米线固定在微流控 芯片内实现了外泌体的分离。除此之外，基于免疫 学的分离方法，因其特异性高，经常与微流控芯片
结合用于特异性分离外泌体。Y. T. K a n g等人[8]和R. G.Q i等人M2]通过将对外泌体表面膜蛋白敏 感的抗体或适配体固定在微流控芯片表面，从而实 现外泌体的分离。为了提高捕获效率，2019年，P. Zhang等人[13]在微流控芯片中设计制备了特殊的三维结构，以提高外泌体与修饰在芯片内表面上 抗体的碰撞概率，从而提高捕获效率。但是目前这 些微流控芯片仍然存在捕获效率低和纯度不高的局 限性。为了应对这一挑战，本文设计并制作了一款 基于磁分离的外泌体高效率捕获以及高纯度分离的 微流控芯片。
本课题组[14]早期已成功制备了一款用于白细胞分离的微流控芯片，通过制备镍薄膜结构构建强 梯度磁场分离白细胞。为了扩展该微流控芯片中构 建梯度磁场的镍薄膜结构应用场景，本文设计并制 备了一款基于免疫磁珠的胃癌细胞源外泌体分离的 微流控芯片，该微流控芯片同样使用了镍薄膜结构 构建强梯度磁场。为了确保外泌体被有效分离，通 过有限元软件COMSOL M ultiphysics优化微流控 芯片内微流道结构，设计了微过滤器以提高外泌体 分离的纯度。然后利用微电子机械系统（M EM S)工艺制备出仿真优化的微流控芯片。最后利用免疫 磁珠捕获胃癌细胞上清液中的外泌体，通过该微流 控芯片实现外泌体的分离。
1实验原理与实验方法
1.1实验原理
外泌体表面含有丰富的蛋白质，其中CD63蛋 白是在外泌体膜上广泛表达的跨膜蛋白[8]。基于此，本文利用CD63抗体与粒径3()0 n m的超顺磁性的纳 米磁珠（MNP)制备免疫磁珠（IMNP)。免疫磁珠 与样本中的外泌体结合，形成外泌体与免疫磁珠复 合物（Exosome@IMNP)，Exosome@IMNP在磁场 中将受到磁场力的作用。为了便于分析粒子在微流 控芯片中的受力情况，本文假设Exosome@IMNP 是质量为/^的球体。根据牛顿第二定律，该球体 在微流控芯片内的受力情况为n5]
497
微鈉电子技术
= F m+ F d(1)
式中：u E、F m和F d分别为Ex〇S〇m e@IM N P在
微流控芯片中运动的速度、受到的磁力和微流体的
曳力；《为时间。由此可知，在微流控芯片中，
Ex〇S〇me@IM N P的运动轨迹主要受到磁力和流体
的曳力影响，在微流控芯片中构造梯度磁场，可以
起到将Ex〇S〇me@IM N P与其他非磁性杂质颗粒分
离的目的。为了进一步提高分离外泌体的纯度，设
计了微过滤器，该结构由不同间距的微栅栏构成，
依次将样本中不同粒径的颗粒阻拦在外。具体的分
离原理示意图如图1所示。
»Exosome@ IMNP
杂质颗粒
图1微流控芯片分离外泌体原理示意图
Fig. 1Schematic diagram of the exosomes separation
using microfluidic chips
2微流控芯片制备
本文使用m e m s工艺制备微流控芯片。微流 控芯片由玻璃衬底和PDMS(道康宁2120)盖板 两部分组成，包含了三个进样口、一个废液口、一
个收集口和分离腔室（图2 (a))。为了在玻璃衬 底上制备构建梯度磁场的镍薄膜结构，首先，将 5 p m厚正性光刻胶（安智4330，德国）旋涂于洁 净的玻璃衬底上，使用光刻工艺图形化该薄膜结构，然后溅射30nm/150n m厚的Cr/N i金属层，接着利用丙酮去除多余的光刻胶，最终制备出镍薄 膜结构（图2 (b))。之后，将S U-8胶（Micro-Chem SU8-3050，美国）旋涂于洁净的硅片上，使用UV-L IG A技术制备微流道模具，然后将PD M S进行倒模再剥离从而制成PD M S盖板。将 二者通过氧等离子体表面改性之后对准键合，在 70 °C烘箱中烘烤2 h，以实现两者不可逆的结合(图 2 (c))。
(a)微流控芯片3D示意图
(b)用于构建梯度磁场的
镍薄膜结构
(c)微流控芯片
实物照片
图2微流控芯片3D示意图、镍薄膜结构及
微流控芯片实物照片
Fig. 2 3D schematic diagram of the microfluidic chip and photos of the Ni thin film structure and microfluidic chip
1.3免疫磁珠的制备
本文使用CD63抗体（圣克鲁斯，美国）与 300 n m粒径的纳米磁珠（苏州海狸，中国）构建 免疫磁珠以捕获外泌体。首先取l()〇M L m米磁珠 (10 mg/m L)放置于1.5 m L离心管中，加人200 P L E D C溶液（l()mg/m L，赛默飞，美国）和200 p L磺基-N H S溶液（10 mg/m L，赛默 飞，美国），并在25 °C下活化30 m in。之后磁分 离除去上清液，并使用400 p L磷酸盐缓冲液(P B S)(p H= 7.4)洗涤5次。接下来，添加40叫CD63抗体，并将混合物在垂直混合器上混合2 h 以在25 °C下形成免疫磁珠。然后磁分离除去上清液，加人 400/uL封闭液（pH= 7.2，lOjug/mL牛 血清蛋白，〇.OSpL/m L吐温-20)并在25 °C下 封闭反应1h。随后，使用P B S(p H= 7.4)洗涤 免疫磁珠3次，以去除未反应的蛋白质。最后，将 免疫磁珠重悬于400 p L的P B S(p H=7.4)中，并在4 °C下保存备用。
1.4免疫磁珠捕获外泌体效率实验验证
本文使用的人胃癌细胞株（M GC- 803)购自 中国科学院细胞研究所。为研究免疫磁珠对外泌体 的捕
获效率，利用纳米粒度分析仪（Zetasizer Nano S，英国）对实验样本进行表征。首先对未处理的300 y L胃癌细胞上清液进行粒径分析。然
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吁子贤等：基于MEMS技术的外泌体磁分离微流控芯片
后将1U U p L免疫磁珠添加到1() m L胃癌细胞上清
液中，并在室温下培育3(> m in，之后利用磁分离
去除纳米磁珠，接着取上清液500 p L进行粒径分
析。对比分析两者在3()〜150 ru n粒径粒子的浓度
变化，分析捕获效率。
1.5使用微流控芯片分离外泌体
为研究微流控芯片对外泌体的分离性能，首先
将1〇() y L免疫磁珠添加到10 m L胃癌细胞上清液
中，并在室温下培育3U min。将孵育的细胞上清液
通过进样口以50 pL/m in的体积流量注人微流控
芯片。同时，将PBS(PH= 7.4)溶液以相同的体
积流量从缓冲液的人口注人微流控芯片。最后从出
口收集分离出的样品进行测试。
2结果与讨论磁分离
2.1微流控芯片仿真结果分析
为了阻挡样本中的杂质粒子进入收集口中，在
微流道内设计了微过滤器结构，微过滤器结构由4
行平行的微栅栏结构构成，每一行微栅栏由独立的
微形长方形（长4() p m，宽20 p m)组成，其中
长方形之间最小间距为10 pm。首先，微过滤器能
够阻挡粒径大于1() 的粒子进人收集口的流道，
从而防止了大颗粒的污染物被收集。更重要的是，
微过滤器会使微流控芯片内部的流体分布更加合
理。为了证明这一点，对流道进行仿真实验，得出
的仿真实验结果如图3所示。含有微过滤器的流道
仿真结果如图3 (a)所示，微过滤器将流道内部
的流体划分为3个相对独立的微流体（微流体1、
流速/(m m-s—1)
(a)制备了微过滤器结构
微流道内部流体分布
流速/(m m-s_1)
(b)未制备微过滤器微
流道内流体分布
图3含微过滤器和不含微过滤器的微流控
芯片流体分布仿真结果
Fig. 3 Simulation results of fluid distribution on the microfluidic chip with and without the microfilter 微流体2和微流体3), 3个流体相对独立，保证了 在没有外力的作用下样品中的粒子很难从微流体1进人微流体3中，进而保证了收集液的纯度。作为 对比，未设置微过滤器的流道仿真结果如图3 (b)所示，人口注入的流体逐渐向中间混合，形成了单 一流体，这样就难免会使样本中的杂质颗粒混人收 集口中，从而导致分离的外泌体不纯。
2.2微流控芯片结构表征
通过有限元仿真软件，设计了合理高效的微流 控芯片结构，然后通过UV-LIGA技术制备出该芯片。为了确定实际制备的芯片尺寸与设计尺寸是否 相符，本文使用扫描电子显微镜（SEM)对制备的 微流控芯片内部关键部位进行表征。图4 U)为微 流道SEM图，从图中可以看出，实际制备的微过滤 器处于微流道中央，微过滤器结构完整、排列整齐。之后为了观察微过滤器的实际尺寸，以45°人射角观 察微过滤器结构，如图4 (b)所示，其中微过滤器 的最小单元长方体的长度为（40±1.5>pm、宽度为 (20±1.
5)ym，与设计尺寸相比可知，实际制备的 微流控芯片精度可达1.5 微流控芯片内部结构 的高精度制备是分离外泌体的重要保障。
(a)制备了微过滤器结构微流（b)微过滤器SEM图
道SEM图
图4微流控芯片流道和微过滤器的S E M图
Fig. 4 SEM images of the microfluidic chip flow
channel and microfilter
2.3微流控芯片分离外泌体实验结果
使用制备的粒径为3()() n m的免疫磁珠捕获外 泌体形成Exosome@IM NP，该复合物在磁场的作 用下将从微流体1偏转至微流体3中，从而被收 集。首先，使用透射电子显微镜（TEM)对纳米 磁珠进行表征，作为对分离结果的参考，如图5 (a)所示，纳米磁珠粒径分布均匀，形状呈规则圆 形。样本经过微流控芯片处理后，从收集口收集样 本，使用T E M对收集样本进行表征，如图5 (b)所示，与图5 (a)对比发现，收集样本中可以清
499
撳鈉电子技术
10°
10丨
102
103
粒径/nm
(a )免疫磁珠捕获前后粒径分布
(b )收集液与废液的粒径分布 图6
免疫磁珠捕获前后样本、收集液与废液样本内粒子粒径分布
Fig. 6 Particle size distributions in the initial samples, the
samples processed by IMNPs and the samples from the collection port and waste port
3结论
本文通过有限元仿真软件，设计了高效合理的
微流控芯片结构•分析了微过滤器对微流道内部流 体分布的影响，仿真结果证明微过滤器会使流道内 部流体分布更加合理，有利于外泌体分离。之后， 利用M EM S 工艺成功制备了设计的微流控芯片， 而且制备的微流控芯片尺寸精度可达1.5 pm 。然 后利用制备的免疫磁珠捕获外泌体后，利用微流控 芯片进行分离，通过对收集的样品进行T E M 观 察，证明了免疫磁珠能够捕获外泌体且捕获效率可 达60. 2%，且微流控芯片能够有效地将外泌体与 磁珠的复合物从复杂样品中分离出来，分离纯度可 达76. 8%
。
本文制作的微流控芯片为外泌体分离
提供了新的途径。
参考文献：
[1]
GHOSSEIN R A, BHATTACHARYA S, ROSAI J. Molecular detection of micrometastases and circulating tumor cells in solid tumors [J]. Clinical Cancer Research, 1999, 5 (8)： 1950- 1960.
(下
转第
544页
）
晰观察到粒径为3()(>n m 的磁珠，此外在磁珠的周 围能够观察到具备双层膜结构的纳米囊泡（图中红 虚线圈出）。实验结果表明，制备的免疫磁珠能 够有效捕获外泌体，并且在微流控芯片中能够将外 泌体和磁珠复合物成功地分离至收集口，这也证明 了设计的微流控芯片分离外泌体的有效性。为了进 行微流控芯片对于外泌体分离性能的定量分析，首 先对免疫磁珠的捕获效率进行分析，通过计算样本 中捕获前后粒子占比变化之比可得到捕获效率，即
ct ~ c2
E c =-—-
(2)
式中£c 、c ，和〇分别为捕获效率、捕获前粒子占 比和捕获后粒子占比。免疫磁珠捕获前后的粒径分 布如图6 (a )所示，粒径为40〜150 n m 的粒子占 比由16. 1%下降至6.4%，由式（2)可计算出捕 获效
率为60.2%。实验结果中，粒径为30〜 40 n m 的粒子比例并未下降，可能是杂质粒子无法 被免疫磁珠捕获。之后对收集液和废液的样品同样 进行粒径分布分析，粒径分布如图6 (b )所示。 废液的粒径分布峰值多，表明废液样本中的粒子粒 径尺寸不单一、杂质多。而收集口的粒径分布的峰 值少，而且粒子粒径主要集中分布在330〜 600 nm ，考虑到外泌体与磁珠结合之后的粒径会 发生变化，根据外泌体的粒径以及一个外泌体结合 多个磁珠的情形，可知Ex 〇S 〇me @IM N P 的尺寸应 该分布在330〜6(M )nm ，实验结果表明该范围的粒 子占比为76.8%，也表明了微流控芯片外泌体的 分离纯度可达76. 8%。
(a )粒径为300 nm 的纳米
（b )微流控芯片处理样本后
磁珠的TEM 图
收集口处样本的TEM 图
图5纳米磁珠和微流控芯片收集口 处样本的T E M 图
Fig. 5 TEM images of nanomagnetic beads and the sample
at the collection port of the microfluidic chip
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