第一章：绪论
细胞工程(cell engineering)：根据人们的需要，在体外对生物的细胞进行生长与分化的调控、遗传重组与改良，使其生产出人类所需要的产品。 方法：遗传重组与改良、细胞融合、核质移植、细胞器移植、染体移植、转基因。
产品：生物的组织、器官、个体；药物(抗体、多肽药物、小分子药物、素、香精)；蛋白质(酶)等
1902年：德国植物学家Gottlieb Haberlandt在世界上首次开展了植物组织培养研究，他分离和培养了许多单子叶植物的叶肉细胞，并进行了培养。[Gottlieb Haberlandt(哈布兰特): 从事植物组织体外培养研究的第一人] 1937年： White建立了第一个组织培养的综合培养基，为White培养基(怀特培养基) [MS培养基是1962年为培养烟草而设计，MS培养基使用最广]
1952年(第一例无病毒植株)：Morel等人通过培养感染了病毒病的大丽花的分生组织(meristem)，得到了无病毒植株，栽培后所开花朵又美丽如初，恢复了观赏价值。
1958年：Reinert和Steward等成功地将胡萝卜韧皮部单细胞培养成完整的植株，证明了细胞全能性假说。
1959年：Morel在进行兰花脱毒培养时发现了兰花可以通过组织培养技术进行快速无性繁殖，并于1960年首次报道了该发现。大大促进了兰花组织培养技术的研究和应用，为国际兰花工业的形成和发展奠定了基础，相继一些有重要观赏价值的兰花实现了大规模化生产，产生了巨大的经济效益。
细胞工程实验的基本需要:实验准备包括培养基配制、器皿洗涤、培养基和器皿灭菌等;无菌操作;控制培养 一 实验室组成:1.基本实验室：A、准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作，要求宽敞明亮，通风条件好(准备工作：器皿的洗涤、培养基的配制与分装、培养基和器皿的灭菌;组成：洗涤区、灭菌区、贮藏区、培养基配制区)B、无菌操作室：进行无菌操作，要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌状态；组成： 缓冲准备区（更换衣
帽、拖鞋、洗手等）；接种区（培养材料的无菌操作）无菌操作室功能简单，面积应小，门窗密闭性好，以保证其长期处于较好的无菌状态C、培养室：对离体材料进行控制条件下的培养；要求是可控制光温，保持相对无菌状态：温度：25～27℃(植物)，35～37℃(动物)；光照强度：2000～3000 lx；配置适宜的培养架；对于某些精细培养类型(如细胞培养和原生质体培养等)，也可采用光照培养箱或人工气候室代替培养室2.辅助实验室;
A、 细胞学实验室：对培养材料进行细胞学鉴定和研究；由制片室和显微观察室组成；要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染
B、 生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查；大型的次生产物生产实验室，还应建立有效物质分离实验室
3.细胞工程实验室布局：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察
二 基本设备及使用
Section 1 细胞工程实验室组成
1、基本设备:⑴天平：2～3台不同精度的天平（0.001或0.0001，0.01或0.1g）⑵冰箱：用于各种维生素和激素类药品及培养基母液的保存、某些实验材料的低温处理；需1～2台，有时需用到超低温冰箱（-80℃）⑶酸度计;用于测定培养基及其它溶液的pH;一般要求可测定pH范围1-14之间，精度0.01即可⑷离心机:用于细胞、原生质体等活细胞分离(用低速离心机)；用于细胞器、核酸以及蛋白质的分离(用高速冷冻离心机)；规模化生产次生产物(选择大型离心分离系统)⑸加热器：用于培养基的配制；电炉、微波炉⑹纯水装置：离体培养应使用符合试验要求的纯水或蒸馏水；蒸馏水器；纯水机⑺分装设备：用于大型生产实验室培养基的分装
2.灭菌设备：（1）高压蒸汽灭菌锅：手提式 、立式 、卧式；⑵干热消毒柜（烘箱）；⑶过滤灭菌装置；⑷喷雾消毒器；⑸紫外灯
3. 无菌操作设备 ：⑴超净工作台（净化工作台）：通过空气过滤去除微生物和灰尘颗粒来达到净 化目的的装置；由鼓风机、滤板、操作台和照明灯等部分组成；单人式和双人式；垂直式和平流式 ；⑵接种箱
4.培养设备： 根据需要选用不同规格和控制精度的设备：培养架；培养箱；摇床（或振荡
培养箱）；生物反应器
5. 光温控制设备： 照度计、时间程序控制器、空调及温度感应器
6.细胞学相关设备 ：各种显微镜；流式细胞仪
Section 2 无菌操作技术
一、试验器皿及洗涤
（一）、试验器皿
1.培养容器：玻璃容器—无并不产生颜折射的玻璃材质（各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶）；塑料容器—材质轻、不易破碎、制作方便，使用广泛（一次性的和可重复使用的）
2.金属用具：细胞工程实验室的接种以及解剖工具，通常使用金属制品【镊子(植物组织解剖用小尖头镊子，继代培养中的转管操作使用型长镊子，16-22cm)；剪刀(不锈钢医用剪刀，做取材和切段转移繁殖，长14-22cm)；解剖刀(用于组织切段，多用短柄可换刀片的医
用不锈钢解剖刀)】
3.其他用具：各种封口膜、盖、塑料盘及其它塑料用品
（二）、实验器皿洗涤
1、玻璃器皿的洗涤;A、初次使用:附有游离的碱性物质的清洗方法：1%盐酸浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂刷洗，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1～2次，干燥后即可使用。B、已使用过的：试管、烧杯、三角瓶：现将器皿中的残渣除去，用合成洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1～2次；;吸管、滴管、移液管：先放入铬酸洗涤液中浸泡2 h以上，取出后经流水冲洗0.5 h左右，再用蒸馏水冲洗1～2次，晾干备用;;载玻片、盖玻片：先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几个小时或用稀铬酸洗涤液煮沸0.5 h，取出后清水冲洗干净，储藏于95％的酒精中备用C、其他;沾过传染性样品或污染的容器，应先进行高压灭菌后再进行清洗;;盛过各种有毒药品，特别是剧毒药品和放射性同位素物质的容器，必须经过专门处理，确知没有残余毒物存在方可进行清洗
2、塑料用品的洗涤：用合成洗涤剂洗涤，并反复冲洗多次，最后用蒸馏水冲洗；或：2% NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，2％～5% HCl浸泡30 min，再用自来水和蒸馏水依次冲洗
3、金属器械的洗涤：新的金属器械常涂有防锈油，可先用沾有汽油的纱布擦去，再用自来水和蒸馏水洗净，最后用酒精棉棉球擦拭晾干；；使用过的：用自来水和蒸馏水洗净，再用酒精棉球擦拭晾干
4、橡胶制品的洗涤：新购置胶塞、胶管等：先用0.5 mol/L NaOH煮沸15 min，然后流水冲洗，再用0.5 mol/L HCl煮沸15 min，流水冲洗，自来水煮沸两次，最后用蒸馏水煮沸20 min，50 ℃烘干备用（除去胶塞上的滑石粉等有毒物质）；；用过的胶塞可按玻璃器材的方法清洗
二、常用灭菌和消毒方法：分为物理灭菌方法和化学灭菌方法
（1）物理灭菌方法：⑴湿热灭菌：利用蒸汽或沸水灭菌；；穿透力强；；常用方法：高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法、煮沸消毒法、巴氏消毒法
（2）过滤除菌：通过机械性阻留微生物而达到无菌要求；选用过滤器0.22μm孔径，可以完全除菌；；适用范围：不能高温灭菌的溶液（如维生素、酶液、血清等）；；设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器；；优点：不破坏溶液中的生物活性物质，不产生有害物质；；缺点：只适用少量滤液；需大量无菌空气以及净化工作台
过滤灭菌时要注意：A. 溶液中的成分必须完全溶解，不能有悬浮物或沉淀物，否则会堵塞微孔滤膜。如确有悬浮物或沉淀物，应先离心。 B. 要注意滤膜是否破裂（使用时可根据经验判断；使用完后可检查滤膜）。 C. 过滤时不要用力过大，否则会导致滤膜破裂。
（3）干热灭菌：采用灼烧或干热空气灭菌；干燥高热空气的穿透力不如湿热蒸汽强，但使用方便；常用方法：火焰灭菌法、干热灭菌法
①火焰灭菌法：通过火焰高温灼烧进行灭菌；接种环、接种针、剪刀、镊子等通过灼烧可彻底灭菌；试管口、玻璃瓶口等通过几次火焰，温度可达200℃以上，可杀死一切微生物和芽孢
②干热灭菌法：利用加热的高温空气进行灭菌；烘箱；适用于玻璃器皿和金属器械等物品的灭菌；160℃～180℃ 40 min，或120℃ 2 h；玻璃器皿放入烘箱前必须完全干燥，以免引起破裂；灭菌温度要缓慢上升，灭菌后待温度下降到100 ℃下才能开箱门
（4）辐射灭菌：利用辐射产生的能量进行杀菌；分电离辐射和非电离辐射；α-射线、β-射线、γ-射线、X-射线、中子和质子等属电离辐射；紫外线为非电离辐射
紫外线（UV）杀菌：直接破坏微生物的核酸和蛋白质等，间接通过臭氧杀死微生物；紫外线穿透力很弱，只适用于表面消毒
简易过滤器2、化学杀菌利用化学药剂进行杀菌或抑菌的方法 ；常用化学药剂种类：重金属盐类、氧化性消毒剂、还原性消毒剂、表面活性消毒剂、抗生素
⑴重金属盐类：重金属盐类对微生物有毒害作用，如汞、银、铅、锌、铜等；原理：重金属离子带正电，容易与带负电的菌体蛋白结合，使其凝固变性；低浓度重金属离子与酶或某些活性物质的活性基团（如巯基）结合，杀死或抑制微生物
2 氧化性消毒剂：原理：通过强烈的氧化作用破坏微生物的原生质或酶蛋白的结构；常用的氧化剂有高锰酸钾、过氧化氢、臭氧、过氧乙酸、漂白粉等；高锰酸钾、过氧化氢常用的浓度为1%；过氧乙酸为0.2-0.5%；漂白粉为0.5-1.2%
3 还原性消毒剂：甲醛常用，能与蛋白质的氨基结合，引起变性；福尔马林为37-40%的甲醛，5%的福尔马林溶液常用于防腐和种子表面消毒，可杀死细菌芽孢和真菌孢子；常用于培养室、接种室的熏蒸灭菌（100 ml甲醛加5 g高锰酸钾为一个使用剂量单位每20 m2放置一个单位）
4 表面活性消毒剂：乙醇、石炭酸（苯酚）、来苏水、新洁尔灭等为常用表面活性消毒剂；乙醇能降低表面张力，改变细胞膜的渗透性及原生质的结构状态，使蛋白质凝固变性；石炭酸及其衍生物也使蛋白质凝固变性，损伤微生物细胞壁和质膜，常用1％～2%浓度；新洁尔灭（化学名称十二烷基溴化胺）能破坏细胞膜的渗透性
⑸抗生素：常用双抗（青霉素、链霉素）、卡那霉素；加入到培养基中，终浓度为：青霉素—100单位/mL培养基；链霉素—100μg /mL培养基；卡那霉素—50μg/mL培养基
三、无菌操作室的消毒
气体熏蒸－甲醛(100ml)＋高锰酸钾(5g)/20m2；紫外照射－用30W的紫外灯照射30分钟；
喷洒消毒液－ 75%乙醇、过氧乙酸或2％新洁尔灭溶液。
四、无菌操作：植物外植体的表面消毒；；污染是植物组织培养的大敌。来源：培养基消毒不彻底；操作污染；植物材料自身污染；培养室不洁净而污染
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