刘主;唐淳
【摘 要】顺磁弛豫增强(PRE)指未配对单电子与原子核之间的偶极相互作用导致了后者弛豫速率的加快.虽然对PRE的理论描述可追溯至上世纪50年代,但是运用于蛋白质结构的解析仅发生在最近10年.该综述中,首先阐述PRE的原理,介绍PRE实验所用的脉冲序列和1H核横向弛豫增强速率的两点时间测量法.其次,介绍目前所用的各种顺磁探针.接着,回顾近年来PRE在对蛋白质稳态和瞬态结构的研究中的应用.最后,对PRE的发展作了展望,包括差比顺磁弛豫增强(DiSPRE)技术,PRE新型探针的开发以及异核检测等,以期对蛋白质的溶液结构和动力学特性作出更完善的表征.%Paramagnetic relaxation enhancement (PRE) refers to acceleration of relaxa tion rates via dipole-dipole interactions between an unpaired electron and a nucleus. The theoretical framework of PRE was laid in the 1950s, yet its applications in studying pro tein structures only took place in the last decade. In this review, the theories underpin ning PRE and the approaches to measure PRE rates are introduced. The commonly used paramagnetic probes for generating PRE in protein systems are reviewed. The principles of using PRE to characterize protein ground-state structure and transient excited-state structure are described. Further improvements of PRE techniques affording more de tailed and comprehensive information regarding protein structure and dynamics are envi sioned.
【期刊名称】《波谱学杂志》
【年(卷),期】2011(028)003
【总页数】16页(P301-316)
【关键词】顺磁弛豫增强(PRE);蛋白质瞬态结构;蛋白质动力学
【作 者】刘主;唐淳
【作者单位】波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所),湖北武汉 430071;波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所),湖北武汉 430071
【正文语种】中 文
cpich
【中图分类】O482.53;Q71
引言
解析具有原子分辨率的蛋白质结构的常用手段，有X射线晶体学和核磁共振(NMR)等.用晶体学和传统的NMR手段所解得的蛋白质结构通常是出现频率高、能量低的稳态结构.蛋白质在溶液中同时存在着多种构象，每种构象出现的频率取决于它们的能级分布，能级高、出现频率低的构象称为瞬态结构[1].构象体之间的相互转化使得各种生化过程如酶催化、别构效应、蛋白质识别与组装成为可能[2].蛋白质溶液结构的动态变化正是生命现象在分子、原子层次的体现.因此，揭示这些动态变化是洞悉蛋白质功能的分子机制的关键，如何表征蛋白质的瞬态结构，以及它们与稳态结构之间的相互转化，已成为了当今生物物理及结构生物学中的一个重要命题.
蛋白质的稳态结构和瞬态结构之间的相互转化跨越了多个时间尺度.已有多种核磁共振技术来表征不同时间尺度的动力学特性：在ps～ns尺度的动力学特性可以通过测量R1、R2弛豫
阶梯教室
速率和异核NOE来描述[3]；μs～ms尺度可通过弛豫扩散(relaxation dispersion)[4,5]，ms～s尺度可用Z轴交换谱，在更慢的时间尺度则可通过氢氘交换来观察.但这些技术只是提供了蛋白质中哪些氨基酸残基参与了这种构象变化和变化的时间尺度，并没有给出与稳态结构相互交换的瞬态结构.接下来我们介绍顺磁弛豫增强(PRE,paramagnetic relaxation enhancement的缩写)的原理以及如何运用该技术来表征蛋白质的瞬态结构.加密代理
1 PRE原理
1.1 PRE的产生
核磁共振所研究的通常是抗磁(diamagnetic)分子，而尽量避免顺磁(paramagnetic)分子的“污染”.借鉴电子顺磁共振(EPR)的经验，近年来我们和世界上多个小组通过分子生物学或者有机化学的方法，在蛋白质表面特异性的链接一个g张量为各向同性的顺磁探针，包括氮氧自由基、EDTA-Mn2+等.这些探针提供未配对单电子，通过与核之间的偶极-偶极相互作用引起核的弛豫速率加快，即PRE效应.PRE的实验系统不具有伪接触化学位移PCS(pseudo-contact shift)效应所造成的化学位移变化，也没有居里自旋弛豫引起的其它交叉相干弛豫，分析起来相对简单.链接有顺磁探针的蛋白质处于顺磁态，而未链接顺磁探针
或是连有对照抗磁探针的蛋白质处于抗磁态.在实验中，我们通常研究 1H核的横向弛豫增强速率(1H-Γ2速率).相比于 1H核的纵向弛豫增强速率(1H-Γ1速率)，1H-Γ2速率强度为前者的10倍以上，因而能较准确的测定[6].在高场条件下(1H频率≥500 MHz)，蛋白质分子上的 1H核与顺磁探针的未配对单电子之间由于偶极-偶极相互作用引起的 1H-Γ2速率定义为：
Γ2=()2g2S(S+1)r-6[4τc+]
(1)
(1)式又称Solomon-Bloomberg公式[7,8].公式中，μ0代表真空磁导率，γI代表 1H核旋磁比，g即电子的g因子，μB代表未配对单电子的磁矩，S代表电子自旋量子数，r代表 1H核与未配对单电子之间的距离，τc代表PRE相干时间，ωH为 1H核的拉摩尔频率.
不同的顺磁中心由于有着不同的电子自旋量子数和相干时间，所导致的PRE也就不同.如氮氧自由基的电子自旋量子数S为1/2，过渡金属Mn2+为5/2，镧系金属Gd3+为7/2.PRE效应的强度还由相干时间τc决定，定义为，其中τr代表蛋白分子的旋转相干时间，τs为电子弛豫时间，Mn2+和Gd3+的τs都在10 ns左右，而氮氧自由基的τs可达100 ns以上.
从(1)式还可以看出，类似于核与核之间的偶极相互作用即NOE，PRE同距离的-6次方成比例.当所链接的顺磁探针具有一定的柔性，即顺磁中心不是固定的，探针与蛋白质存在着一定的相对运动，因此(1)式中的r-6就应表述为一个平均值，即〈r-6〉 .
1.2 2点时间法测量 1H-Γ2速率简易信号发生器
用来测量1HN-Γ2的脉冲序列如图1所示[6]，该实验是基于15N-1H的异核单量子相干谱(HSQC)，来测量蛋白质主链酰胺氢的横向弛豫速率.在T+2τa的时间里面，15N的180°脉冲将 1H的横向磁矩裂分为快和慢2项弛豫部分(Hy-2HyNz和Hy+2HyNz)，这2部分的贡献是一致的，从而导致总的衰减呈单指数过程，因此实验中，观测到的衰减几乎是同一相位的 1H核的横向弛豫的演化[9].
图1 用于2点时间法测量 1H-Γ2的脉冲序列.这个脉冲序列是基于15N-1H的异核单量子相干谱，T在实验中是个变量，通过分析核磁信号如何随T而变化就可以求出横向弛豫速率
Fig.1 Pulse sequence for measuring 1H-Γ2 rates using two or more time points.The pulse sequence is based on 15N-1H hetero-nuclear single-quantum correlation(HSQC),in which
the length of T can be adjusted.Analysis of the modulation of peak intensities as a function of T affords the PRE measurement
利用这一脉冲序列，PRE实验采用2点时间法来测量 1H-Γ2弛豫速率[9].第2个时间点b的信号强度与第1个时间点a的信号强度、1H核本身的横向弛豫速率、1H-Γ2速率以及时间T有如下关系：
Idia(Tb)=Idia(Ta)exp(-R2,diaT)
(2)
Ipara(Tb)=Ipara(Ta)exp[-(R2,dia+Γ2)T]
(3)
根据(2)式和(3)式，1H核的横向弛豫增强速率即PRE可由下列公式求得：
(4)
(4)式中，Idia、Ipara分别是抗磁态和顺磁态 1H核的峰强，T=Tb-Ta.通常我们将Ta设为一个很短的时间，如几个μs，Tb则根据 1H核本身的弛豫速率和PRE的大小一般设为若干个ms；Ta和Tb在脉冲序列中交错实施.对于非氘代的蛋白质，虽然 3JHN-Hα在T时间段内有演化，但它对顺磁和抗磁态的峰强的贡献是一致的，(4)式则可将它抵消，因此保持抗磁和顺磁实验中Ta和Tb的一致很重要.(4)式也同时抵消了交换过程对横向弛豫速率R2的影响，最终结果仅来自电子-核的相互作用.Γ2的误差σ(Γ2)可以通过误差的扩散求出，具体公式是：
σ×
(5)
(5)式中，σdia、σpara分别是抗磁态，顺磁态实验结果中每一个峰强所对应的噪音.考察(4)式和(5)式，通过对T的优化和提高实验信噪比的方法可以减小σ(Γ2).
电子顺磁共振PRE可以用图1所示的脉冲序列实验测得，若已知蛋白质结构，也可以通过对(1)式求导而得.实验值同理论值之间的吻合程度用Q-因子来衡量：
(6)
(6)式中和对应于蛋白质中每一个氨基酸的观察值和计算值.
1.3 单点时间法测量 1H-Γ2速率
PRE的测量还可用较为简单的单点时间测量方法[10].这种方法仅仅是采集顺磁、抗磁2个样品的HSQC谱，利用(7)式计算得到：
-Γ2τ)
(7)
(7)式中τ表示 1H核的磁化处于横向的时间，对于HSQC实验大约为9.2 ms.由于顺磁标记会加快 1H核的纵向弛豫速率，使得抗磁和顺磁样品平衡恢复的程度不一，因此只有当恢复时间特别长，即>5 T1时，(7)式才准确.对于2H标记的蛋白，酰胺基 1H核的T1可达数秒，因此纵向弛豫需要10 s～20 s才会100％的恢复，通常HSQC实验设置的恢复时间(0.8 s～2.0 s)则远远达不到这个要求.而顺磁探针的引入使得样品在同样的恢复时间内能更快的达到平
衡，这样就造成了系统误差.另外，(7)式假设 1H维是洛仑兹线型的，处理中可通过不加窗函数获得，但这样处理的一个后果是谱会展宽，可分析峰的数量相应减少.从实际应用角度考虑，(7)式无法直接求解，只能通过拟合得到一个近似的数值.总之，用单点时间法对PRE进行定量分析时要非常谨慎.
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