一种高效检测核酸酶及抑制效果的方法与流程

1.本发明涉及核酸酶检测领域，具体是一种高效检测核酸酶及抑制效果的方法。

背景技术：

2.cd8 t细胞是机体发挥抗肿瘤免疫功能的最关键细胞，在识别肿瘤抗原后，cd8 t细胞活化并分化为具有肿瘤杀伤功能的效应cd8 t细胞。然而，肿瘤微环境中存在大量免疫抑制性细胞如调节性t细胞(treg)和肿瘤相关巨噬细胞(tam)等，表达多种免疫抑制性分子(pd-l1等)形成免疫抑制性微环境，抑制cd8 t细胞抗肿瘤功能的发挥。阻断pd-1/pd-l1可一定程度上恢复cd8 t细胞的效应功能，但作用十分有限。因此，如何更加有效的增强cd8 t细胞的效应功能，是突破肿瘤免疫耐受瓶颈的关键。
3.rna结合蛋白可介导rna的转录后调控(如rna的加工成熟，翻译和降解)，从而快速灵活调控细胞的rna和蛋白水平，该特点对于快速、精准的免疫应答调控十分重要。研究发现，cd8 t细胞的活化和效应功能受到精细的转录后调控：cd8 t细胞的早期活化过程中，细胞内mrna的含量增加不明显(约1.4倍)，但翻译效率却提高了5倍以上；期间，杀伤功能相关基因(如cd8a，tbx21，itga1itgal和itgax等)的mrna的翻译效率更是与cd8 t细胞的效应功能呈正相关；靶向t细胞的rna降解过程可以显著提高cd4和cd8 t细胞的分化和效应功能。
4.传统的肿瘤手段存在以下不足：
5.传统肿瘤手段(手术、放疗和化疗)无肿瘤特异性，副作用大且容易诱发肿瘤耐药和转移，很难从根本上治愈肿瘤。肿瘤免疫是通过增强患者自身免疫系统(以t细胞为主)的抗肿瘤能力，进行肿瘤的方法，包括t细胞过继疗法、嵌合抗原受体t细胞疗法(car-t)和免疫检查点阻断疗法，具有特异性强、副作用小、抗肿瘤效果持久、有效防止癌细胞的扩散和复发、逆转肿瘤细胞的耐药性等优点，是发展最为迅速、最具前景的新一代肿瘤方法。然而，上述方式存在t细胞功能增强不足，导致肿瘤杀伤效果有限，因此，如何更加有效的增强t细胞功能是肿瘤免疫的关键。

技术实现要素：

6.基于此，有必要针对现有技术问题，提供一种高效检测核酸酶及抑制效果的方法。
7.为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案为：
8.包括以下步骤：
9.s1：搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列；
10.s2：表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布；
11.s3：定点诱导dna断裂、荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率；
12.s4：表达与纯化do1核酸内切酶-strep蛋白；
13.s5：利用do1核酸内切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞；
14.s6：采用细胞计数或结晶紫染方法测定细胞增殖能力；
15.s7：测定细胞增殖能力；
16.s8：在利用do1核酸内切酶抑制对肿瘤放射和化学的致敏作用。
17.进一步，所述搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列包括以下步骤：
18.s11：通过ncbi数据库搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列，利用生物信息学软件绘制do1核酸内切酶基因在不同物种的进化树和do1核酸内切酶的蛋白质功能结构域；
19.s12：采用crispr/cas9技术编辑do1核酸内切酶基因，获得do1核酸内切酶基因敲除或突变细胞株；
20.s13：采用sirna技术沉默do1核酸内切酶基因，以敲低do1核酸内切酶基因表达；
21.s14：提取rpe-1细胞的蛋白质，通过sds-page电泳分离蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜；
22.s15：采用特异性的兔抗do1核酸内切酶和羊抗兔hrp二抗检测do1核酸内切酶蛋白质水平。
23.进一步，所述表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布包括以下步骤：
24.s21：采用免疫荧光、染质免疫共沉淀和核质分离的方法表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布；
25.s22：在diva细胞中开展chip实验，由4-oht诱导asisi-er核酸内切酶的表达，在染体chr1:89,458,595-89,458,603处产生dna断裂；
26.s23：4-oht诱导5小时后，利用特异性抗体沉淀相应蛋白质；
27.s24：通过pcr扩增确定蛋白质在dna断裂位点处的富集水平。
28.进一步，所述定点诱导dna断裂、荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率包括以下步骤：
29.s31：采用i-sce1核酸内切酶定点诱导dna断裂，荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率；
30.s32：采用可被多西环素诱导表达的野生型对do1核酸内切酶缺陷细胞进行功能互补实验；
31.s33：通过免疫荧光实验测定do1核酸内切酶缺陷的细胞在dna损伤后，各种相关的dna修复因子在dna损伤位点的聚集能力。
32.进一步，所述表达与纯化do1核酸内切酶-strep蛋白包括以下步骤：
33.s41：do1核酸内切酶基因全长及其突变体通过pcr扩增后亚克隆到pgex4t1-2strep载体上，并转化至bl21大肠杆菌菌株中；
34.s42：将带有do1核酸内切酶质粒的细菌在38℃的环境下培养至对数生长期，加入1mm iptg诱导蛋白表达，在17℃的环境下继续培养16小时后离心收集细菌；
35.s43：将菌体重悬于netn裂解液中，利用超声破碎细胞后21000x g离心，收集上清液；
36.s44：在上清液中加入netn裂解液预先洗涤过的strep-tactin xt磁珠，5℃中孵育1.5小时后弃去上清液；
37.s45：利用netn裂解液洗涤磁珠6次，加入sds上样缓冲液提取纯化蛋白；
38.s46：通过蛋白质免疫印迹检测纯化蛋白。
39.进一步，所述netn裂解液由以下成分组成：
40.200mm nacl；
41.40mm tris-cl[ph 8.0]；
[0042]
1mm edta0.6％nonidet p-40。
[0043]
进一步，所述利用do1核酸内切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞包括以下步骤：
[0044]
s51：在正常细胞中敲除do1核酸内切酶基因，并将细胞连续传代，测定其增殖曲线，实验周期为21天；
[0045]
s52：在肿瘤细胞中沉默do1核酸内切酶基因，并将细胞连续沉默，测定其增殖曲线，实验周期为21天；
[0046]
s53：计算存活细胞数并存图记录；
[0047]
s54：根据细胞计数结果计算增值率，增值率＝(nt-n0)/nt*100％，其中nt是实验终点细胞计数绝对值，n0是初始细胞接种数；
[0048]
s55：将所有测定细胞系对照组与实验组实验终点增值率进行双尾t-test检验。
[0049]
进一步，所述采用细胞计数或结晶紫染方法测定细胞增殖能力包括以下步骤：
[0050]
s61：在rpe-1和2f4细胞中将do1核酸内切酶与其他功能基因共同沉默，采用细胞计数方法测定细胞增殖能力
[0051]
s62：在rpe-1和2f4细胞中将do1核酸内切酶与酶抑制剂连用，采用结晶紫染方法测定细胞增殖能力。
[0052]
进一步，所述测定细胞增殖能力包括以下步骤：
[0053]
s71：在rpe-1或肿瘤细胞中将do1核酸内切酶与tp53功能基因共同沉默，测定细胞增殖能力；
[0054]
s72：将tp53表达质粒转入肿瘤细胞，同时沉默do1核酸内切酶基因表达，通过细胞计数的方法测定恢复功能的tp53基因对do1核酸内切酶细胞毒性的拯救效应。
[0055]
进一步，所述在利用do1核酸内切酶抑制对肿瘤放射和化学的致敏作用包括以下步骤：
[0056]
s81：在24孔板中接种1万细胞，24小时进行do1核酸内切酶基因沉默实验，实验周期设定为21天；
[0057]
s82：根据细胞生长速率调整每次传代接种细胞数；
[0058]
s83：每次传代24小时进行do1核酸内切酶sirna转染实验，并得出实验结果。
[0059]
所述高效检测核酸酶的氨基酸序列为seq id no：1或seq id no：2，或所述高效检测核酸酶的氨基酸序列为seq id no：1或seq id no：2所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性；所述氨基酸序列为seq id no：1的高效检测核酸酶来源于盐杆菌dl1菌株，或所述氨基酸序列为seq id no：2的高效检测核酸酶来源于闪烁古生球菌。
[0060]
本发明与现有技术相比具有的有益效果是：
[0061]
其一，本发明通过给对象服用足够剂量的do1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，用于或预防带有tp53、pten等抑癌基因突变、基因表达或功能缺陷的肿瘤。
[0062]
其二，本发明通过给对象服用足够剂量的do1核酸内切酶抑制物可以对低剂量的放化疗起到增敏作用，用于对放射或化疗药物单独无有效临床反应的肿瘤。
具体实施方式
[0063]
为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
[0064]
一种高效检测核酸酶及抑制效果的方法，包括以下步骤：
[0065]
s1：搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列；
[0066]
s2：表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布；
[0067]
s3：定点诱导dna断裂、荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率；
[0068]
s4：表达与纯化do1核酸内切酶-strep蛋白；
[0069]
s5：利用do1核酸内切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞；
[0070]
s6：采用细胞计数或结晶紫染方法测定细胞增殖能力；
[0071]
s7：测定细胞增殖能力；
[0072]
s8：在利用do1核酸内切酶抑制对肿瘤放射和化学的致敏作用。
[0073]
具体地，所述搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列包括以下步骤：
[0074]
s11：通过ncbi数据库搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列，利用生物信息学软件绘制do1核酸内切酶基因在不同物种的进化树和do1核酸内切酶的蛋白质功能结构域；
[0075]
s12：采用crispr/cas9技术编辑do1核酸内切酶基因，获得do1核酸内切酶基因敲除或突变细胞株；
[0076]
s13：采用sirna技术沉默do1核酸内切酶基因，以敲低do1核酸内切酶基因表达；
[0077]
s14：提取rpe-1细胞的蛋白质，通过sds-page电泳分离蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜；
[0078]
s15：采用特异性的兔抗do1核酸内切酶和羊抗兔hrp二抗检测do1核酸内切酶蛋白质水平。
[0079]
并通过ensembl数据库显示do1核酸内切酶基因组位点含有两个外显子和一个内含子。genetree软件分析do1核酸内切酶基因在不同物种的进化关系，发现其同源基因存在于珊瑚、鱼类、脊椎动物和人等高等真核生物中，而不存在于酵母、果蝇和线虫等低等真核生物。
[0080]
具体地，所述表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布包括以下步骤：
[0081]
s21：采用免疫荧光、染质免疫共沉淀和核质分离的方法表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布；
[0082]
s22：在diva细胞中开展chip实验，由4-oht诱导asisi-er核酸内切酶的表达，在染体chr1:89,458,595-89,458,603处产生dna断裂；
[0083]
s23：4-oht诱导5小时后，利用特异性抗体沉淀相应蛋白质；
[0084]
s24：通过pcr扩增确定蛋白质在dna断裂位点处的富集水平。
[0085]
通过一系列生物学实验证实do1核酸内切酶在dna损伤位点聚集并活化，参与dna修复，保证遗传物质的稳定性。
[0086]
具体地，所述定点诱导dna断裂、荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率包括以下步骤：
[0087]
s31：采用i-sce1核酸内切酶定点诱导dna断裂，荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率；
[0088]
s32：采用可被多西环素诱导表达的野生型对do1核酸内切酶缺陷细胞进行功能互补实验；
[0089]
s33：通过免疫荧光实验测定do1核酸内切酶缺陷的细胞在dna损伤后，各种相关的dna修复因子在dna损伤位点的聚集能力。
[0090]
dna断裂损伤主要通过非同源末端链接(nhej)、同源重组(hr)和单链dna融合(ssa)三种途径进行修复，并受到多种修复因子的调控，其中，dna末端回切形成单链dna的程度是选择这些修复途径的重要调控事件。在实施例2中发现的基础上，更多的实验证明do1核酸内切酶直接募集到dna断点并调控dna末端回切，是调控修复途径选择的重要分子。
[0091]
具体地，所述表达与纯化do1核酸内切酶-strep蛋白包括以下步骤：
[0092]
s41：do1核酸内切酶基因全长及其突变体通过pcr扩增后亚克隆到pgex4t1-2strep载体上，并转化至bl21大肠杆菌菌株中；
[0093]
s42：将带有do1核酸内切酶质粒的细菌在38℃的环境下培养至对数生长期，加入1mm iptg诱导蛋白表达，在17℃的环境下继续培养16小时后离心收集细菌；
[0094]
s43：将菌体重悬于netn裂解液中，利用超声破碎细胞后21000x g离心，收集上清液；
[0095]
s44：在上清液中加入netn裂解液预先洗涤过的strep-tactin xt磁珠，5℃中孵育1.5小时后弃去上清液；
[0096]
s45：利用netn裂解液洗涤磁珠6次，加入sds上样缓冲液提取纯化蛋白；
[0097]
s46：通过蛋白质免疫印迹检测纯化蛋白。
[0098]
do1核酸内切酶具有经典的核酸内切酶结构域，为验证其核酸内切酶的活性，我们利用细菌表达并纯化了do1核酸内切酶-strep蛋白质，包括do1核酸内切酶全长和多肽片段(1-344、22-344)，并检测其对不同类型dna的酶切反应，结果如下：
[0099]
0.5微克纯化do1核酸内切酶加入1微克各种pegfp-c3质粒dna，在buffer3.1和cut smart缓冲液中进行体外消化反应(37oc，16小时)结果表明do1核酸内切酶可以切割带有结构损伤的dna分子，如紫外线损伤、dna双链断裂(5’和3’overhang)、氧化损伤(过氧化氢处理)，而对完整质粒没有切割效应。
[0100]
具体地，所述netn裂解液由以下成分组成：
[0101]
200mm nacl；
[0102]
40mm tris-cl[ph 8.0]；
[0103]
1mm edta0.6％nonidet p-40。
[0104]
具体地，所述利用do1核酸内切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞包括以下步骤：
[0105]
s51：在正常细胞中敲除do1核酸内切酶基因，并将细胞连续传代，测定其增殖曲线，实验周期为21天；
[0106]
s52：在肿瘤细胞中沉默do1核酸内切酶基因，并将细胞连续沉默，测定其增殖曲线，实验周期为21天；
[0107]
s53：计算存活细胞数并存图记录；
[0108]
s54：根据细胞计数结果计算增值率，增值率＝(nt-n0)/nt*100％，其中nt是实验终点细胞计数绝对值，n0是初始细胞接种数；
[0109]
s55：将所有测定细胞系对照组与实验组实验终点增值率进行双尾t-test检验。
[0110]
dna损伤应答是真核细胞维持基因组稳定性的重要机制，当损伤不能正常修复时将导致细胞死亡。实施例3已经证实，do1核酸内切酶基因的沉默导致rad52调控ssa通路异常，影响dna修复，可能影响细胞的存活。因此，我们利用细胞增殖实验测定do1核酸内切酶对不同种类细胞增殖能力的影响，发现了do1核酸内切酶基因沉默对肿瘤细胞的特异性抑制作用，但不影响正常细胞的生存，表明do1核酸内切酶功能抑制具有潜在的肿瘤效果。
[0111]
具体地，所述采用细胞计数或结晶紫染方法测定细胞增殖能力包括以下步骤：
[0112]
s61：在rpe-1和2f4细胞中将do1核酸内切酶与其他功能基因共同沉默，采用细胞计数方法测定细胞增殖能力
[0113]
s62：在rpe-1和2f4细胞中将do1核酸内切酶与酶抑制剂连用，采用结晶紫染方法测定细胞增殖能力。
[0114]
大多数肿瘤细胞存在dna损伤修复的缺陷，为研究do1核酸内切酶基因缺失特异性抑制肿瘤细胞增殖的机制，本发明利用基因沉默或酶抑制剂干扰dna损伤应答或修复因子的功能，模拟肿瘤细胞内的dna应答缺陷，发现do1核酸内切酶基因沉默与包括atm、chk1和同源重组修复因子在内的大多数dna损伤应答因子的缺陷联合致死。
[0115]
具体地，所述测定细胞增殖能力包括以下步骤：
[0116]
s71：在rpe-1或肿瘤细胞中将do1核酸内切酶与tp53功能基因共同沉默，测定细胞增殖能力；
[0117]
s72：将tp53表达质粒转入肿瘤细胞，同时沉默do1核酸内切酶基因表达，通过细胞计数的方法测定恢复功能的tp53基因对do1核酸内切酶细胞毒性的拯救效应。
[0118]
在rpe-1和2f4细胞中沉默pten抑癌基因，发现2f4对pten沉默具有相对较高的敏感性。说明抑制除tp53之外的抑癌基因也可以与抑制do1核酸内切酶功能联合致死。因此，可以通过给对象服用足够剂量的do1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，用于或预防带有tp53、pten等抑癌基因突变、基因表达或功能缺陷的肿瘤。
[0119]
具体地，所述在利用do1核酸内切酶抑制对肿瘤放射和化学的致敏作用包括以下步骤：
[0120]
s81：在24孔板中接种1万细胞，24小时进行do1核酸内切酶基因沉默实验，实验周期设定为21天；
[0121]
s82：根据细胞生长速率调整每次传代接种细胞数；
[0122]
s83：每次传代24小时进行do1核酸内切酶sirna转染实验，并得出实验结果。
[0123]
实验结果显示，沉默的正常细胞对dna毒性放化疗药物不敏感，但是肿瘤细胞中沉默do1核酸内切酶可以极大地提高对放化疗处理的敏感性。因此，给对象服用足够剂量的do1核酸内切酶抑制物可以对低剂量的放化疗起到增敏作用，用于对放射或化疗药物单独无有效临床反应的肿瘤。潜在的联合药物包括从铂类、丝裂霉素c、喜树碱、parp抑制剂、放射性同位素、长春花生物碱、抗肿瘤烷基化药物、单克隆抗体、抗代谢药物。这些方法可以同时或先后使用，体现协同效应，使效果优于单独使用抑制do1功能的药物或单独使用抗肿瘤药物的方法。
[0124]
所述高效检测核酸酶的氨基酸序列为seq id no：1或seq id no：2，或所述高效检
测核酸酶的氨基酸序列为seq id no：1或seq id no：2所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性；所述氨基酸序列为seq id no：1的高效检测核酸酶来源于盐杆菌dl1菌株，或所述氨基酸序列为seq id no：2的高效检测核酸酶来源于闪烁古生球菌。
[0125]
以上实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：

1.一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列；s2：表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布；s3：定点诱导dna断裂、荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率；s4：表达与纯化do1核酸内切酶-strep蛋白；s5：利用do1核酸内切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞；s6：采用细胞计数或结晶紫染方法测定细胞增殖能力；s7：测定细胞增殖能力；s8：在利用do1核酸内切酶抑制对肿瘤放射和化学的致敏作用。2.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列包括以下步骤：s11：通过ncbi数据库搜索do1核酸内切酶基因和蛋白质序列，利用生物信息学软件绘制do1核酸内切酶基因在不同物种的进化树和do1核酸内切酶的蛋白质功能结构域；s12：采用crispr/cas9技术编辑do1核酸内切酶基因，获得do1核酸内切酶基因敲除或突变细胞株；s13：采用sirna技术沉默do1核酸内切酶基因，以敲低do1核酸内切酶基因表达；s14：提取rpe-1细胞的蛋白质，通过sds-page电泳分离蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜；s15：采用特异性的兔抗do1核酸内切酶和羊抗兔hrp二抗检测do1核酸内切酶蛋白质水平。3.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布包括以下步骤：s21：采用免疫荧光、染质免疫共沉淀和核质分离的方法表征do1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布；s22：在diva细胞中开展chip实验，由4-oht诱导asisi-er核酸内切酶的表达，在染体chr1:89,458,595-89,458,603处产生dna断裂；s23：4-oht诱导5小时后，利用特异性抗体沉淀相应蛋白质；s24：通过pcr扩增确定蛋白质在dna断裂位点处的富集水平。4.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述定点诱导dna断裂、荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率包括以下步骤：s31：采用i-sce1核酸内切酶定点诱导dna断裂，荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率；s32：采用可被多西环素诱导表达的野生型对do1核酸内切酶缺陷细胞进行功能互补实验；s33：通过免疫荧光实验测定do1核酸内切酶缺陷的细胞在dna损伤后，各种相关的dna修复因子在dna损伤位点的聚集能力。5.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述表达与纯化do1核酸内切酶-strep蛋白包括以下步骤：s41：do1核酸内切酶基因全长及其突变体通过pcr扩增后亚克隆到pgex4t1-2strep载
体上，并转化至bl21大肠杆菌菌株中；s42：将带有do1核酸内切酶质粒的细菌在38℃的环境下培养至对数生长期，加入1mm iptg诱导蛋白表达，在17℃的环境下继续培养16小时后离心收集细菌；s43：将菌体重悬于netn裂解液中，利用超声破碎细胞后21000x g离心，收集上清液；s44：在上清液中加入netn裂解液预先洗涤过的strep-tactin xt磁珠，5℃中孵育1.5小时后弃去上清液；s45：利用netn裂解液洗涤磁珠6次，加入sds上样缓冲液提取纯化蛋白；s46：通过蛋白质免疫印迹检测纯化蛋白；其中netn裂解液由以下成分组成：200mm nacl；40mm tris-cl[ph 8.0]；1mm edta0.6％nonidet p-40。6.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述利用do1核酸内切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞包括以下步骤：s51：在正常细胞中敲除do1核酸内切酶基因，并将细胞连续传代，测定其增殖曲线，实验周期为21天；s52：在肿瘤细胞中沉默do1核酸内切酶基因，并将细胞连续沉默，测定其增殖曲线，实验周期为21天；s53：计算存活细胞数并存图记录；s54：根据细胞计数结果计算增值率，增值率＝(nt-n0)/nt*100％，其中nt是实验终点细胞计数绝对值，n0是初始细胞接种数；s55：将所有测定细胞系对照组与实验组实验终点增值率进行双尾t-test检验。7.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述采用细胞计数或结晶紫染方法测定细胞增殖能力包括以下步骤：s61：在rpe-1和2f4细胞中将do1核酸内切酶与其他功能基因共同沉默，采用细胞计数方法测定细胞增殖能力s62：在rpe-1和2f4细胞中将do1核酸内切酶与酶抑制剂连用，采用结晶紫染方法测定细胞增殖能力。8.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述测定细胞增殖能力包括以下步骤：s71：在rpe-1或肿瘤细胞中将do1核酸内切酶与tp53功能基因共同沉默，测定细胞增殖能力；s72：将tp53表达质粒转入肿瘤细胞，同时沉默do1核酸内切酶基因表达，通过细胞计数的方法测定恢复功能的tp53基因对do1核酸内切酶细胞毒性的拯救效应。9.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述在利用do1核酸内切酶抑制对肿瘤放射和化学的致敏作用包括以下步骤：s81：在24孔板中接种1万细胞，24小时进行do1核酸内切酶基因沉默实验，实验周期设定为21天；s82：根据细胞生长速率调整每次传代接种细胞数；
s83：每次传代24小时进行do1核酸内切酶sirna转染实验，并得出实验结果。10.一种高效检测核酸酶，包括如权利要求1-9任意一项所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法，其特征在于，所述高效检测核酸酶的氨基酸序列为seq id no：1或seq id no：2，或所述高效检测核酸酶的氨基酸序列为seq id no：1或seq id no：2所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性；所述氨基酸序列为seq id no：1的高效检测核酸酶来源于盐杆菌dl1菌株，或所述氨基酸序列为seq id no：2的高效检测核酸酶来源于闪烁古生球菌。

技术总结

本发明涉及核酸酶检测领域，具体涉及一种高效检测核酸酶及抑制效果的方法，包括以下步骤：S1：搜索DO1核酸内切酶基因和蛋白质序列；S2：表征DO1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布；S3：定点诱导DNA断裂、荧光定量PCR测定HR，NHEJ和SSA修复的相对效率；S4：表达与纯化DO1核酸内切酶-STREP蛋白；S5：利用DO1核酸内切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞；S6：采用细胞计数或结晶紫染方法测定细胞增殖能力；S7：测定细胞增殖能力；S8：在利用DO1核酸内切酶抑制对肿瘤放射和化学的致敏作用。本发明通过给对象服用足够剂量的DO1核酸内切酶抑制物或SSA增强剂，用于或预防带有TP53、PTEN等抑癌基因突变、基因表达或功能缺陷的肿瘤。能缺陷的肿瘤。

技术研发人员：

童吉宇 何容莹

受保护的技术使用者：

成都普乐密欣生物技术有限公司

技术研发日：

2022.10.19

技术公布日：

2022/12/12