gateway构建干涉载体步骤

图1 目的载体pH7GWIWG2（I）

张力计算

克隆获得目的基因后，通过序列比对等方法寻该基因的特异性序列片段，分别设计特异引物及含有一半attB接头序列的引物。

引物Primers	引物序列Primer Sequences
GENE -F GENE -R attB- GENE -F attB- GENE -R attB-adapter-F attB-adapter-R	5′- NNNNNNNNNNNNNNNNN -3′ 5′- NNNNNNNNNNNNNNNNN -3′ 5′- AA AAA GCA GGC T NNNNNNNNNNNNNNNNN -3′ 5′- A GAA AGC TGG GT NNNNNNNNNNNNNNNNN -3′ 5′- GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CT -3′ 5′- GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT -3′

1、根据特异性片段序列，设计引物GENE –F/GENE –R，RT-PCR获得目的片段。

2、以步骤一得到的cDNA片段为模板，用引物attB- GENE –F/attB- GENE –R进行扩增获得attB-1-PCR产物。

3、以步骤二得到的目的片段为模板，用引物attB-adapter-F/attB-adapter-R进行扩增，得到attB-PCR产物。

4、纯化回收attB-PCR产物。

（1）室温下，在缠绕膜复卷机1.5 ml eppendorf管中加入下列反应体系，并混匀，25℃温育过夜。

试剂名称	体积（反应体系：10 µL）载体构建
attB-PCR 回收产物	2 µL
pDONRTM vector（150 ng/ µL）	1 µL
BP ClonaseTM enzyme mix	1 µL
5 × BP ClonaseTM Reaction Buffer	2 µL
TE Buffer （pH8.0）	无铬钝化液4 µL

（2）加1 µL Proteinase K solution，37℃温育10 min，以终止BP反应。

（3）BP反应混合物转化感受态细胞。

6、PCR检测BP反应阳性克隆，挑取检测正确的克隆进行测序。将测序正确的克隆提取质粒，进行LR反应。

7、LR反应

（1）室温下，在1.5 mL 离心管中加入下列反应体系，并混匀，25℃温育过夜：

表2 LR反应体系

光碟机

试剂名称	体积（反应体系：10 µL）
Entry clone （100-300 ng）	1 µL
Destination vector （300 ng）	1 µL
LR ClonaseTM enzyme mix	2 µL耐热钢焊接
5 × LR ClonaseTM Reaction Buffer	2 µL
TE Buffer，pH 8.0	4 µL