使用一氧化氮供体化合物COVID-19和其他传染病的新方法与流程

使用一氧化氮供体化合物covid-19和其他传染病的新方法
技术领域
1.本发明提供了使用一氧化氮供体化合物传染病(例如，covid-19)的新方法。
2.交叉引用相关申请
3.本技术要求2021年1月6日提交的申请号为63/134,579的美国临时专利申请的权益，该申请的全部内容通过引用并入本技术。
4.本技术要求2020年11月30日提交的申请号为63/119,539的美国临时专利申请的权益，该申请的全部内容通过引用并入本技术。
5.本技术要求2020年11月7日提交的申请号为63/111,019的美国临时专利申请的权益，该申请的全部内容通过引用并入本技术。
6.本技术要求2020年6月1日提交的申请号为63/033,194的美国临时专利申请的权益，该申请的全部内容通过引用并入本技术。
7.本技术要求2020年3月28日提交的申请号为63/001,289的美国临时专利申请的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术：

8.sars-cov-2病毒和相关的covid-19大流行对全球公共卫生产生了负面影响。一种能够预防疫情爆发和/或降低发病率或死亡率的安全有效的方案将对这一流行病产生重大影响，并减轻covid-19对人类社会和世界经济的破坏性影响。疫苗开发和定期改进将是解决方案的一部分，但长期结果和疫苗安全性尚不确定，而公众接受度有限，可能无法实现所谓的covid-19体免疫。似乎没有一种控制大流行的方法是完全令人满意的，并且将无限期地需要免疫和的结合，以及对高危人保持社交距离。本发明解决了未满足的传染病需求，包括最紧迫的covid-19。
9.目前，covid-19的特效方案很少。然而，我们知道一氧化氮作为肺血管扩张剂，对急性呼吸窘迫综合征继发低氧血症具有价值。一氧化氮气体在临床和实验模型中对其他冠状病毒株具有抗病毒活性。促进全身和肺血管中no释放的新型输送系统可以降低与covid-19相关的发病率和死亡率。
10.covid-19肺炎造成缺氧。死亡最终是由于缺氧。处理这个问题的策略应该包括在缺氧的情况下扩张血管和调节炎症反应。本技术所述专利化合物旨在解决这些挑战并提供益处。
11.尿素转运蛋白基因slc14(溶质载体14)家族调节尿素跨细胞膜转运。ut-b(尿素转运蛋白b，slc14a1基因的产物)促进尿素、水和尿素类似物跨细胞膜的转运，并在心脏、血管内皮和红细胞中表达。细胞内尿素积累导致精氨酸被一氧化氮合酶而非精氨酸酶分解(sun.lau等人，2016)。与来自人类血管内皮细胞的过表达文库中的常氧(20％)相比，缺氧(1％氧气)条件下培养的人血管内皮细胞中slc14a1 mrna显著过度表达。缺氧中ut-b表达的上调应导致尿素转运出内皮细胞，并可能导致先前记录的缺氧中enos-no途径活性的降
低(schmedtie.ji等人，1997)。开发了一种化合物，增强缺氧时no的血管舒张释放，从而克服缺氧时观察到的no减少。no还通过抑制病毒蛋白酶而具有抗病毒活性(saura.zaragoza等人，1999)，并且no供体在体外可抑制sars-cov感染。keyaerts，vijgen等人，2004)开发用于心血管和肺部疾病管理的新型no供体的努力，与新冠肺炎大流行中的实验需求具有新的和更高的相关性。
12.coeutive.inc预计，含有尿素或类似尿素(如乙酰胺)的硝酸盐供体在新冠肺炎(一种以sars-cov-2感染引起的全身性缺氧和炎症为特征的疾病)时，在传递抗病毒no以对抗血管内皮功能障碍方面具有价值。
13.木瓜蛋白酶(plpro)被认为是抑制第一例sars冠状病毒的主要靶点(baez santos st john et al.2015)。在sars-cov-2的研究中，plpro被认为与利巴韦林具有高度亲和力，利巴韦林最初被认为是一种潜在的剂(wu.liu等人，2020年)。然而，本技术所述的一些化合物似乎具有较高的亲和力，因为它们牢固地位于plpro的催化囊中，并与催化囊残基进行了大部分关键的相互作用：leul62-aspl64基序、gly271-tyr264基序。这些数据要求对这些新型抗病毒药物给予新的关注，因为它们似乎与nsp3的plpro和adp核糖磷酸酶结合的亲和力增加(与其他已知抗病毒药物相比)，同时靶向向新冠肺炎中的sars-cov-2病毒传递no。

技术实现要素：

14.因此，在一个方面，本发明提供了传染病的新方法，包括：向有需要的哺乳动物投与有效量的本发明化合物中的至少一种或其药学上可接受的盐。
15.在另一方面，本发明提供了新的药物组合物，其包含：药学上可接受的载体和有效量的本发明化合物中的至少一种或其药学上可接受的盐，其中该组合物适于传染病。
16.在另一方面，本发明提供用于的新化合物或药学上可接受的盐。
17.在另一方面，本发明提供了新化合物用于制造传染病的药物的用途。
18.通过发明人的发现，本发明的化合物或其药学上可接受的盐有望提供专注于与传染病相关的病原体的反应，这些和其他目标在以下详细描述中将变得明显。
附图说明
19.图1a-d：图1a是plpro催化袋中的顶部命中化合物和对照化合物的叠加图：leu162-aspl64基序，gly271-tyr264基序；图1b显示化合物cr-0305；图1c显示化合物cr-0.607；图id显示化合物cr-510；如图1b-d所示，据预测，化合物cr-0305、cr-0607和cr-0510对催化袋残留物具有关键的相互作用。
20.图2a-d：图2a是adp核糖磷酸酶催化位点中的顶部命中化合物和对照化合物的叠加图：图2b显示化合物cr-0504；图2c显示化合物cr-0.502；图2d显示化合物cr.0402；如图2b-d所示，据预测，化合物cr-0504、cr-0502和cr-0402对结合囊残基具有关键的相互作用。
21.图3a-b：提供了(图3a)cr-0305和(图3b)grl-0617与催化位点中的pl
pro
蛋白残基的详细配体原子相互作用的示意图。
22.图4a-d：提供了与pl
pro
活性位点残基和cr-0305和grl-0617的蛋白质-配体相互作
cov-2木瓜蛋白酶pl
pro
的催化位点的结合出奇的稳定和亲和力，指出了另一种潜在的作用机制，尤其是在心血管并发症的情况下。cr-0305是一种no供体，作为一种抗心绞痛药物，可以在局部缺氧的情况下调节炎症和血管扩张。sars-cov-23cl水解酶(m
pro
)是抗病毒药物的重要靶点(choudhary.shaikh等人，2020年)，但sars-cov-2的木瓜蛋白酶(pl
pro
)是抑制sars病毒的主要靶点，因为它通过减弱1型干扰素反应介导病毒复制并调节宿主免疫反应。(mantlo，bukreyeva et al.2020；mcclain，vabret 2020；shin，mukherieeet al.2020)cr-0305不仅可以作为no供体，还可以作为pl
pro
的直接抑制剂。这种双重效应证明对控制新冠肺炎大流行有用。
28.所提出的cr-0305在新冠肺炎中作用机制涉及cr-0305在其催化位点与蛋白酶plpro结合，同时利用与plpro的亲和力将一氧化氮(no)以硝酸盐基团的形式靶向传递到sars-cov-2，该硝酸盐基团附着在2-碳上的异山梨酯上。根据计算机数据，cr-0305在结合pl
pro
方面优于grl-0617、remdesivir、gs-441524、lopinavir、boceprevir和ribavirin。与其他抗病毒药物相比，cr-0305似乎对sars-cov-2具有更高的亲和力，因为它牢固地位于pl
pro
催化囊中，并与关键催化囊氨基酸glyl63、asp 164、g1y271和tyr264进行了最关键的相互作用。cr-0305可能优于no和其他抗病毒药，因为在计算机数据中，cr-0305与pl
pro
的催化位点结合，阻断病毒复制所必需的蛋白酶活性，并抑制基于干扰素的细胞防御机制，同时以抗病毒no向新冠肺炎中的sars-cov-2病毒的传递作为攻击目标。
29.传染病是由病毒(病毒感染)、细菌(细菌感染)、原生动物或蠕虫(寄生虫感染)或真菌(真菌感染)中的至少一种引起的疾病。由于一氧化氮可以抗病毒(macmicking.xie等人，1997年；zell markgraf等人，2004年)、抗细菌(feura等人，2018年)、抗寄生虫(muro和perez-arellano，2010年；yim.park等人，2018年)和抗真菌(stasko-mchale等人，2018)以及本发明的化合物可以作为一氧化氮供体，因此本发明的化合物可以该传染病。
30.因此，在一个方面，本发明提供了一种传染病的新方法，包括：向有需要的患者投与有效量的本发明化合物中的至少一种或其药学上可接受的盐。
31.在另一方面，该传染病是由病毒、细菌、分枝杆菌、寄生虫、真菌或其组合引起的。
32.在另一方面，该传染病会导致患者细胞缺氧。
33.在另一方面，患者因该传染病而使用呼吸机。
34.可引起本发明可的传染病的病毒(和病毒感染)的示例包括冠状病毒(sars-cov(sars)、mers-cov和sars-cov-2(新冠肺炎)、a、b和c型流感(流感)、痘苗病毒(天花)、单纯疱疹病毒-1(疱疹)、爱泼斯坦-巴尔病毒(感染性心肌病)和柯萨奇病毒(感染型心肌病)。
35.本发明可的细菌(和细菌感染)的实例包括链球菌(肺炎和链球菌喉咙)、大肠杆菌(尿路感染)、粘质沙雷氏菌(尿路传染)、核梭杆菌(牙周病)、表皮葡萄球菌(败血症)、杆菌()、铜绿假单胞菌(肺炎)、，肺炎克雷伯菌(肺炎)、包括耐甲氧西林金黄葡萄球菌(mrsa)(细胞)、单核细胞增生性李斯特菌(李斯特菌病)、艰难梭菌(艰难梭菌感染)、肠炎沙门菌(沙门氏菌)、伤寒沙门氏杆菌(伤寒)和产气荚膜梭菌(食物中毒)。
36.本发明可的分枝杆菌和分枝杆菌感染的实例包括结核分枝杆菌(结核病)、牛分枝杆菌(牛结核病)、禽分枝杆菌和细胞内分枝杆菌(mac复合感染)和麻风分枝杆菌(汉森病)。
37.本发明可的寄生虫和寄生虫感染的实例包括克氏锥虫病(恰加斯病)、曼氏血
吸虫病(血吸虫病)、弓形虫病(弓形虫病)、恶性疟原虫(疟疾)、重大利什曼原虫病(利什曼病)、卡斯特拉尼氏棘阿米巴(角膜炎)和粪类圆线虫(洛夫特综合征)。
38.本发明可的真菌和真菌感染的实例包括体癣(皮肤真菌病)和白念珠菌(念珠菌病)。
39.另一方面，待使用的化合物为具有化学式i、ii、iii、iv、v或vi的新的化合物：
[0040][0041][0042]
其中，r1空缺；
[0043]
或者，r1(r1的右侧部分连接到异山梨醇酯部分)选自(ch2)2o、(ch2)2nh，、(ch2)3o、(ch2)3nh、ch2c(＝o)o以及ch2c(＝o)nh中的一种；以及
[0044]
r2(r2的右侧部分连接到异山梨醇酯部分)选自(ch2)2o、(ch2)2nh、(ch2)3o、(ch2)3nh、ch2c(＝o)o、ch2c(＝o)nh、ch2oc(＝o)o、ch2oc(＝o)nh、ch2nhc(＝o)o以及
[0045]
ch2nhc(＝o)nh中的一种；
[0046]
或其药学上可接受的盐。
[0047]
另一方面，化合物为化学式i或iv或其药学上可接受的盐。
[0048]
另一方面，化合物为化学式i或iv且r1空缺或其药学上可接受的盐。
[0049]
另一方面，化合物为化学式i或iv或其药学上可接受的盐，且r1选自(ch2)2o、(ch2)2nh、(ch2)3o以及(ch2)3nh中的一种。
[0050]
另一方面，化合物为化学式ii或v或其药学上可接受的盐。
[0051]
另一方面，化合物为化学式ii或v或其药学上可接受的盐，r2选自(ch2)2o、(ch2)2nh、(ch2)3o、(ch2)3nh、ch2oc(＝o)o、ch2oc(＝o)nh、ch2nhc(＝o)o以及ch2nhc(＝o)nh中的一种。
[0052]
另一方面，化合物为化学式iii或ⅵ或其药学上可接受的盐。
[0053]
另一方面，化合物为化学式iii或vi或其药学上可接受的盐，r1空缺。
[0054]
另一方面，化合物为化学式iii或ⅵ或其药学上可接受的盐，r1选自(ch2)2o、(ch2)2nh、(ch2)3o和(ch2)3nh中的一种。
[0055]
量的本发明化合物或其药物上可接收的盐。
[0056]
另一方面，本发明提供了本发明在制备用于传染病的药物中的用途。
[0057]
本发明可以以其他特定形式体现，而不脱离其精神或基本属性。本发明包括本文所述发明的所有方面的组合。应当理解，本发明的任何和所有实施例可以与任何其他实施例结合使用以描述其他实施例。还应理解的是，实施例的每个单独元件都可以单独作为其自己的独立实施例。此外，实施例的任何元素意在与任何实施例中的任何和所有其他元素组合以描述附加实施例。
[0058]
定义
[0059]
除非另有说明，否则本技术定义中提供的示例是非包容性的。它们包括但不限于所列举的示例。
[0060]
细胞缺氧是指单个细胞级别的缺氧，与整个生物体或环境级别的缺氧无关。
[0061]
本文所述化合物可具有不对称中心、几何中心(例如，双键)或两者都具有。除非特别指明了特定的立体化学或异构形式，否则一个结构的所有手性、非对映体、外消旋体形式和所有几何异构形式都是意指的。含有不对称取代原子的本发明化合物可以以光学活性或外消旋形式分离。本领域众所周知如何制备光学活性形式，例如通过外消旋形式的拆分、通过光学活性起始材料的合成或通过使用手性助剂。烯烃的几何异构体、c＝n双键或其他类型的双键可存在于本文所述化合物中，并且所有此类稳定异构体均包含在本发明中。具体而言，本发明化合物的顺式和反式几何异构体也可能存在，并且可以作为异构体的混合物或分离的异构体形式进行分离。用于制备本发明化合物及其中间体的所有工艺均被视为本发明的一部分。所示或所述化合物的所有互变异构体也被视为本发明的一部分。
[0062]“哺乳动物”和“病人”包括通常接受医疗护理的温血哺乳动物(例如，人类和家养动物)。例如，包括猫、狗、马、牛和人，以及只有人类。
[0063]“”或“诊治”包括对哺乳动物疾病状态的，包括：(a)防止疾病状态在哺乳动物中发生，特别是当该哺乳动物易患疾病但尚未被诊断为患有疾病时；(b)抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或(c)缓解疾病状态，例如，减轻疾病状态直到达到期望的点。还包括改善疾病症状(例如减轻疼痛或不适)，其中这种改善可能直接影响或间接影响疾病(例如原因、传播、表达等)。
[0064]“药物上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过制备其酸或碱盐来修
饰母体化合物。药物上可接受的盐的实例包括但不限于基本残留物如胺的矿物或有机酸盐；酸性残留物的碱或有机盐，如羧酸。药物上可接受的盐包括例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，此类常规无毒盐包括从选自1，2-乙二磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢盐、柠檬酸、伊迪酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、甘氨酸、甘乳酸、己基间苯二酚、羟胺、氢溴酸、盐酸、氢碘化物、羟基马来酸、羟基萘酸、异硫辛酸、乳酸、乳糖仿生、十二烷基磺酸、马来酸酐、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、萘基、硝酸、草酸、二甲酸、泛酸、、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚醋酸、琥珀酸、磺胺酸、磺酰胺酸、硫酸、单宁酸、酒石酸和甲苯磺酸的无机酸和有机酸中衍生的盐。
[0065]
本发明的药学上可接受的盐可由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成。通常，可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当碱或酸在水中或有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备此类盐；通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是有用的。合适的盐列表见雷明顿药房教科书(gaisford，2021)，现通过引用将其公开内容并入本技术。
[0066]“有效量”包括当单独或组合施用以本发明所列适应症时有效的本发明化合物的量。“有效量”还包括声称对所需适应症有效的化合物组合的量。化合物的组合可以是协同组合。如所述(chou和talalav 1984)，当化合物以组合方式施用时的效应大于单独作为单一药剂施用时的化合物加性效应时，会产生协同效应。一般来说，在化合物的次优浓度下，协同效应最为明显。协同作用可以是与单个组分相比，该组合的细胞毒性更低、效果增强或其他一些有益效果。
[0067]
预期本发明的化合物具有如本技术所述的活性。
[0068]
配方和剂量
[0069]
在本发明中，本发明化合物可以以任何方便的方式使用(例如，肠内或肠外)。给药方法包括口服和经皮给药。本领域技术人员了解，本发明化合物的给药途径可能会显著不同。除其他口服给药外，缓释组合物可能更受青睐。其他可接受的途径可能包括注射(例如，静脉注射、肌肉注射、皮下注射和腹腔注射)、皮下植入、口腔注射、舌下注射、局部注射、直肠注射、阴道注射和气道内注射(例如通过吸入)。口服制剂的实例包括片剂、包衣片剂、硬胶囊和软胶囊、溶液、乳剂、悬浮液和可雾化组合物。也可使用生物可蚀、不生物降解、生物可降解和不生物降解的给药系统，包括药物洗脱结构，如通过导管放置的支架，可将现有化合物直接输送至血管壁。
[0070]
如果制备片剂形式的固体组合物，则主要活性成分可以与药物载体混合，例如二氧化硅、淀粉、乳糖、硬脂酸镁和滑石。片剂可以用蔗糖或其他合适的物质包衣，也可以对其进行处理，使其具有持续或延迟的活性，从而连续释放预定量的活性成分。明胶胶囊可通过将活性成分与稀释剂混合，并将所得混合物并入软或硬明胶胶囊中获得。糖浆或酏剂可与甜味剂(通常无热量)、防腐剂(例如羟苯甲酯和/或羟苯丙酯)、调味品和适当的颜一起含有活性成分。水分散性粉末或颗粒可含有与分散剂或润湿剂或悬浮剂(如聚乙烯吡咯烷酮)以及甜味剂或味道矫正剂混合的活性成分。可以使用栓剂进行直肠给药，栓剂是由粘结剂在直肠温度下融化制备的(例如可可脂和/或聚乙二醇)。可以使用含水悬浮液、等渗盐水溶液或可注射无菌溶液进行肠外给药，这些溶液含有药理学相容的分散剂和/或润湿剂(例
如，丙二醇和/或聚乙二醇)。活性成分还可以配制为微囊或微球，任选地使用一种或多种载体或添加剂。活性成分也可以与环糊精以络合物的形式呈现，例如α-、β-或γ-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精和/或间乙基-β-环糊素。
[0071]
每日施用的本发明化合物的剂量将因个体而异，并且在某种程度上可以根据所疾病的严重程度来确定。本发明化合物的剂量也将根据施用的化合物而变化。本发明化合物的剂量示例包括约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、76、80、85、90、95至100mg/kg哺乳动物体重。该化合物可在一段时间内单剂量或少量施用。施用该化合物的时间长短因个体而异，可以持续到达到预期结果。因此，可以持续1天到几周、几个月甚至几年，这取决于正在的受试者、期望的结果以及受试者对根据本发明进行的的反应速度。
[0072]
本发明的片剂的可能示例如下：
[0073][0074][0075]
本发明胶囊的可能示例如下：
[0076][0077]
在上述胶囊中，活性成分具有合适的粒径。结晶乳糖和微晶纤维素彼此均匀混合，过筛，然后混合硬脂酸镁。将最终混合物装入合适大小的硬明胶胶囊中。
[0078]
本发明注射溶液的可能示例如下。
[0079][0080]
本发明的局部组合物的可能示例如下。
[0081][0082][0083]
本发明气溶胶制剂的一个可能示例如下(例如，与雾化器一起使用)。
[0084][0085]
本发明的其他特征将在以下示例性实施例的描述过程中变得明显，这些示例性实施方案是为了说明本发明而给出的，并不打算对其进行限制。
[0086]
合成示例
[0087]
本发明化合物可使用下述方法与合成有机化学领域已知的合成方法或本领域技术人员所理解的改变合成。优选方法包括但不限于下述方法。反应在适合所用试剂和材料的溶剂中进行，并且适合受影响的转化。有机合成领域的技术人员将理解，分子上存在的官能团应与提出的转化一致。这有时需要判断以修改合成步骤的顺序，或选择一种特定的工艺方案而不是另一种，以获得本发明所需的化合物。还应认识到，本领域任何合成路线规划中的另一个主要考虑因素是明智地选择用于保护本发明所述化合物中存在的反应性官能团的保护基团。在protective groups in organic synthesis中到了描述受过训练的从业者的许多替代方案的权威说明。(greene and wuts 1991)本技术引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。
[0088]
综合实施例1-34是可用于制备本发明化合物的步骤的代表。综合实施例1-17采用
已知化合物异山梨醇-2-单硝酸酯(5-羟基-1，4：3，6-二氢-d-葡萄糖醇-2-硝酸酯)和5-氨基异山梨酸-2-单硝酯(5-氨基-1，4.3，6-双氢-d-糖醇-2-硝酸盐)，综合实施例18-34采用异山梨基-5-单硝酸酯(2-氨基-1，4：3，6-二氢-d-葡萄糖醇5-硝酸酯)为起始材料。在本发明的详细说明书中，合成示例1-17用于化学式i、ii和iii，合成示例18-34用于化学式iv、v和vi。
[0089]
合成示例1
[0090][0091]
5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)1nhci溶液可在室温下用异氰酸钾处理，搅拌10-12小时，以通过萃取获得2-脲基衍生物(2)。
[0092]
合成示例2
[0093][0094]
5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)可以在n，n
′‑
二环己基碳二亚胺(dcc)和二甲氨基吡啶(dmap)存在下，用二氯甲烷中的n-t-boc-甘氨酸(t-boc＝叔丁基氧羰基)处理。在室温下搅拌过夜后，t-boc酰胺(3)可以用传统方式分离。用三氟乙酸对(3)进行后续处理可以得到脱保护氨基酸加合物(4)，如前所述，在用异氰酸钾和稀hcl溶液处理后，可以得到脲基甘氨酸加合物(5)。
[0095]
合成示例3
[0096][0097]
在吡咯啶嘧啶存在下，用1-环己基-3-(2-吗啉基)碳二亚胺(cmc)在二氯甲烷(dcm)中处理2-单硝酸异山梨酯(6)，可以提供受保护的氨基酸成瘾物(7)。用tfa(三氟乙酸乙酯)去除保护基团可以得到氨基化合物(8)。随后用异氰酸钾和稀释hcl溶液在0℃至环境温度下进行处理，可以得到尿素化合物(9)。
[0098]
合成示例4
[0099][0100]
在存在[cp*ir(pro)cl](pro＝脯氨酸)(cp＝环戊二烯基)的情况下，用t-boc-氨基乙醇或t-boc-3-氨基丙醇在甲苯或水中处理5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)可以得到受保护的二胺加合物(10)。用tfa去除保护基团可以得到伯胺(11)，如前所述，伯胺可以在稀盐酸溶液中使用氰酸钾转化为脲(12a，12b)。
[0101]
合成示例5
[0102][0103]
2-单硝酸异山梨酯(6)可以用氢化钠或二异丙基酰胺锂在四氢呋喃(thf)中脱质子，然后用t-boc-氨基乙基溴或t-boc-3-氨基丙基溴处理，得到醚(12)。使用tfa对t-boc基团的脱保护将产生伯胺(13)，随后如前所述的异氰酸钾处理可产生脲(14)。
[0104]
合成示例6
[0105][0106]
在thf或dcm中用氰基乙酸乙酯处理5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)可以得到尿素(15)。在甲醇中与无水氨进一步反应可以生成脲基甲酰胺(16)。
[0107]
合成示例7
[0108][0109]
在n-甲基咪唑存在下，在乙腈中用氰基乙酸叔丁酯处理2-单硝酸异山梨酯(6)，可以得到氨基甲酸酯(17)。叔丁基的去除可以通过乙醚中的hci或tfa得到羧酸(18)。在dcc存在下，酸与氨的酰胺化可提供酰胺(19)。
[0110]
合成示例8
[0111][0112]
在dcc/dmap或cmc/吡咯啶嘧啶存在下，在dcm中用丙二酸单酰胺处理5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)或异山梨酸-2-单硝酯(6)可分别生成丙二酰胺(20)或丙二酸酯酰胺(21)。
[0113]
合成示例9
[0114][0115]
在约0℃用光气和吡啶处理5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)可产生氨甲酰氯(22a，x＝nh)。在dcm中dmap存在下，这种氨甲酰氯与甘氨酸酰胺在低温下反应，可以得到脲基甲酰胺(23)。或者，氨甲酰氯(22)(x＝nh)可以在dcm中dmap存在的情况下用乙酰胺处理，并得到端羧酰胺基的碳酸盐(24)。如果将异山梨酸-2-单硝酯(6)用作该序列的起始材料，光气反应可以在低温(22，x＝o)下生成羰基氯化物，如果在前面描述的条件下用甘氨酸或乙酰胺处理该中间体，则可以分别制备氨基甲酸酯(25)或碳酸盐(26)。
[0116]
合成示例10
[0117][0118]
在钴催化剂和分子筛存在下，在高温下用3-羟基丙酰胺或4-羟基丁酰胺处理5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)，可分别生成羧酰胺胺(27)和(28)。
[0119]
合成示例11
[0120][0121]
在thf中用氢化钠处理异山梨酯-2-单硝酸酯(6)或在thf中用二异丙胺锂处理，然后用3-溴丙酰胺或4-溴丁酰胺对醇盐进行烷基化，可分别生成羧酰胺醚(29)和(30)。
[0122]
合成示例12
[0123][0124]
在thf中存在三乙胺的情况下，用乙酰氧基乙酰氯处理2-氨基异山梨醇-5-单硝酸酯(1)可以生成酰胺加合物(31)。用氢氧化钠溶液水解醋酸盐可生成羟基酰胺(32)。
[0125]
合成示例13
[0126][0127]
在thf中存在三乙胺的情况下，用乙酰氧基乙酰氯处理异山梨酸-2-单硝酯(6)可以生成酯加合物(33)。乙酸与水解将生成乙醇酸加合物(34)。
[0128]
合成示例14
[0129][0130]
n-乙酰氧基乙酰甘氨酸可以通过在三乙胺存在下用乙酰氧基酰氯处理苄基甘氨酸，然后在钯催化剂存在下苄基酯氢解来制备。在dcc存在下，用乙酰氧基乙酰甘氨酸在dcm中处理5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)可产生乙酰化酰胺加合物(35)。可以通过在甲醇溶液中与氢氧化钾反应或与三甲基氢氧化锡反应来去除醋酸盐(36)。
[0131]
合成示例15
[0132][0133]
在dcc/dmp存在下，在dcm中用乙酰氧基乙酰甘氨酸处理异山梨酸-2-单硝酯(6)可以生成乙酰化酯加合物(37)。乙酸盐(38)的去除可以通过与三甲基氢氧化锡反应来完成。
[0134]
合成示例16
[0135][0136]
在高温下，在钴催化剂和甲苯中的分子筛存在下，用n-t-boc-氨基乙醇或n-t-boc-3-氨基丙醇处理5-氨基异山梨醇-2-单硝酸酯(1)可以提供受保护的氨基化合物(39)。保护基团的去除可以使用tfa完成，tfa可以得到未保护的伯胺(40)。胺(40)在三甲胺存在下与乙酰氧基乙酰氯反应可提供酰胺(41)，随后在甲醇中用koh处理可提供羟基乙酰胺(42和43)。
[0137]
合成示例17
[0138][0139]
用氢化钠或lda在thf中对异山梨醇-2-单硝酸酯(6)进行脱质子反应，然后添加n-t-boc-氨基乙基溴或n-t-boc-3-氨基丙基溴，可以得到受保护的醚(44)。使用tfa对氨基进行脱保护可以得到伯胺(45)，经活性乙酰氯处理后可以得到酰胺(46)。在氢氧化钾中使用氢氧化钾水解醋酸盐可以得到羟乙酰胺(47和48)。
[0140]
合成示例18
[0141][0142]
异氰酸钾在室温下搅拌10-12小时，在常规提取后得到2-脲基衍生物(50)。
[0143]
合成示例19
[0144][0145]
2-氨基-5-单硝酸异山梨酯(49)可以在n，n
′‑
二环己基碳二亚胺(dcc)和二甲氨基吡啶(dmap)存在下，用二氯甲烷中的n-t-boc-甘氨酸(t-boc＝叔丁基氧羰基)处理。在室温下搅拌过夜后，t-boc酰胺(51)可以以传统方式分离。用三氟乙酸对(51)进行后续处理可以提供脱保护氨基酸加合物(52)，如前所述，在用异氰酸钾和稀hci溶液处理后，可以提供脲基甘氨酸加合物(53)。
[0146]
合成示例20
[0147][0148]
在吡咯啶嘧啶存在下，用1-环己基-3-(2-吗啉基)碳二亚胺(cmc)在二氯甲烷(dcm)中处理5-单硝酸异山梨醇酯(54)可以提供受保护的氨基酸成瘾物(55)。用tfa(三氟乙酸乙酯)去除保护基团可提供氨基化合物(56)。随后用异氰酸钾和稀释hcl溶液在0℃至环境温度下进行处理，可以得到尿素化合物(57)。
[0149]
合成示例21
[0150][0151]
在存在[cp*ir(pro)cl](pro＝脯氨酸)(cp＝环戊二烯基)的情况下，用t-boc-氨基乙醇或t-boc-3-氨基丙醇在甲苯或水中处理2-氨基-5-单硝酸异山梨酯(49)可以得到受保护的二氨基加合物(58)。用tfa去除保护基团可以得到伯胺(59)，如前所述，伯胺可以在稀盐酸溶液中使用氰酸钾转化为脲(60a，60b)。
[0152]
合成示例22
[0153][0154]
5-单硝酸异山梨醇酯(54)可以用氢化钠或二异丙基酰胺锂在四氢呋喃(thf)中脱质子，然后用t-boc-氨基乙基溴或t-boc-3-氨基丙基溴处理，得到醚(60)。使用tfa对t-boc基团进行脱保护将得到伯胺(61)，随后如前所述的异氰酸钾处理可得到脲(62)。
[0155]
合成示例23
[0156][0157]
在thf或dcm中用氰基乙酸乙酯处理2-氨基-5-单硝酸异山梨醇酯(49)可以得到尿素(63)。在甲醇中与无水氨进一步反应可以生成脲基甲酰胺(64)。
[0158]
合成示例24
[0159][0160]
在n-甲基咪唑存在下，在乙腈中用氰基乙酸叔丁酯处理5-单硝酸异山梨酯(54)，可以得到氨基甲酸酯(65)。叔丁基的去除可以通过乙醚中的hc1或tfa得到羧酸(66)。在dcc存在下，酸与氨的酰胺化可提供酰胺(67)。
[0161]
合成示例25
[0162][0163]
在dcc/dmap或cmc/吡咯烷嘧啶存在下，在dcm中用丙二酸单酰胺处理2-氨基-5-单硝酸异山梨酯(49)或5-单硝酸异山梨酯(54)可分别生成丙二酰胺(68)或丙二酸酯酰胺(69)。
[0164]
合成示例26
[0165][0166]
在约0℃用光气和吡啶处理2-氨基异山梨醇-5-单硝酸酯(49)可产生氨甲酰氯(70a，x＝nh)。在dcm中dmap存在下，这种氨甲酰氯与甘氨酸酰胺在低温下反应，可以得到脲基甲酰胺(71)。或者，氨基甲酰氯(70a，x＝nh)可以在dcm中dmap存在的情况下用乙酰胺处理，并得到端羧酰胺基的碳酸盐(72)。如果将5-单硝酸异山梨酯(54)用作该序列的起始材料，光气反应可以在低温(70b，x＝o)下生成羰基氯化物，如果在上述条件下用甘氨酸或乙酰胺处理该中间体，则可以分别制备氨基甲酸酯(73)或碳酸盐(74)。
[0167]
合成示例27
[0168]
[0169]
在钴催化剂和分子筛存在下，在高温下用3-羟基丙酰胺或4-羟基丁酰胺处理2-氨基-5-单硝酸异山梨酯(49)，可分别生成羧酰胺胺(75)和(76)。
[0170]
合成示例28
[0171][0172]
在thf中用氢化钠处理5-单硝酸异山梨酯(6)或在thf中用二异丙酰胺锂处理5-单硝异山梨糖酯，然后用3-溴丙酰胺或4-溴丁酰胺将醇盐烷基化，可分别生成羧酰胺醚(77)和(78)。
[0173]
合成示例29
[0174][0175]
在thf中存在三乙胺的情况下，用乙酰氧基乙酰氯处理2-氨基-5-单硝酸异山梨醇酯(49)可以生成酰胺加合物(79)。用氢氧化钠溶液水解醋酸盐可生成羟基酰胺(80)。
[0176]
合成示例30
[0177][0178]
在thf中存在三乙胺的情况下，用乙酰氧基乙酰氯处理5-单硝酸异山梨酯(54)可以生成酯加合物(81)。乙酸与水解将生成乙醇酸加合物(82)。
[0179]
合成示例31
[0180][0181]
n-乙酰氧基乙酰甘氨酸可以通过在三乙胺存在下用乙酰氧基酰氯处理苄基甘氨酸，然后在钯催化剂存在下苄基酯氢解来制备。在dcc存在下，用乙酰氧基乙酰甘氨酸在dcm中处理2-氨基异山梨醇-5-单硝酸酯(49)可产生乙酰化酰胺加合物(83)。可以通过在甲醇溶液中与氢氧化钾反应或与三甲基氢氧化锡反应来去除醋酸盐(84)。
[0182]
合成示例32
[0183][0184]
在dcc/dmp存在下，在dcm中用乙酰氧基乙酰甘氨酸处理5-单硝酸异山梨酯(6)可以生成乙酰化酯加合物(85)。乙酸盐(86)的去除可以通过与三甲基氢氧化锡反应来完成。
[0185]
合成示例33
[0186][0187]
在钴催化剂和分子筛存在下，在高温下用n-t-boc-氨基乙醇或n-t-boc-3-氨基丙醇处理2-氨基-5-单硝酸异山梨酯(49)，可以提供受保护的氨基化合物第(87)节。保护基团
的去除可以使用tfa完成，tfa可以生成未保护的伯胺(88)。胺(88)在三甲胺存在下与乙酰氧基乙酰氯反应可提供酰胺(89)，随后在甲醇中用koh处理可提供羟基乙酰酰胺(90和91)。
[0188]
合成示例34
[0189][0190]
用氢化钠或lda在thf中对5-单硝酸异山梨酯(54)进行脱质子反应，然后添加n-t-boc-氨基乙基溴或n-t-boc-3-氨基丙基溴，可以得到受保护的醚(92)。使用tfa对氨基进行脱保护可以得到伯胺(93)，经活性乙酰氯处理后可以得到酰胺(94)。在氢氧化钾中使用氢氧化钾水解醋酸盐可以得到羟乙酰胺(95和96)。
[0191]
化合物示例
[0192]
表1-6显示了可以如上所述合成的本发明化合物的结构。
[0193]
表1
[0194][0195]
ex.#r1cr-0101absentcr-0102(ch2)2ocr一0103(ch2)2nhcr一0104(ch2)3o
cr-0105(ch2)3nhcr-0106ch2c(＝o)ocr-0107ch2c(＝o)nh
[0196]
表2
[0197][0198]
ex.#r2cr-0201(ch2)2ocr-0202(ch2)2nhcr-0203(ch2)3ocr-0204(ch2)3nhcr-0205ch2c(＝o)ocr-0206ch2c(＝o)nhcr-0207ch2oc(＝o)ocr-0208ch2oc(＝o)nhcr-0209ch2nhc(＝o)ocr-0210ch2nhc(＝o)nh
[0199]
表3
[0200][0201]
ex.#r1cr-0301absentcr-0302(ch2)2ocr-0303(ch2)2nhcr-0304(ch2)3ocr-0305(ch2)3nh
cr-0306ch2c(＝o)ocr-0307ch2c(＝o)nh
[0202]
表4
[0203][0204][0205][0206]
表5
[0207][0208]
ex.#r2cr-0501(ch2)2ocr-0502(ch2)2nhcr-0503(ch2)3ocr-0504(ch2)3nhcr-0505ch2c(＝o)o ch2c(＝o)nhcr-0507ch2oc(＝o)ocr-0508ch2oc(＝o)nhcr-0509ch2nhc(＝o)o
cr-0510ch2nhc(＝o)nh
[0209]
表6
[0210][0211]
ex.#r1cr-0601absentcr-0602(ch2)2ocr-0603(ch2)2nhcr-0604(ch2)3ocr-0605(ch2)3nhcr-0606ch2c(＝o)ocr-0607ch2c(＝o)nh
[0212]
cr-0305的合成
[0213]
合成从tbdps保护的侧链中间体4开始。以44％的总产率制备了总共1.01g的中间体4，为油状物。
[0214]
侧链合成
[0215][0216]
a.1)dmap/tea，tmsci，thf，0℃-rt2h然后2)tea，tbdpsci，rt 16h；b.tea，n-boc-1，3-丙二胺，edc，hobt，rt，24h；c.tfa，dcm，0℃-rt，2h。
[0217]
中间体4的制备如上所示。
[0218]
最终cr-0305合成。
[0219][0220]
d、tf2o，吡啶，dcm，0℃-rt，16h；e、100℃，2h，干净；f、tbaf(thf中1.0m)，thf，rt，2h。
[0221]
1，4：3，6-二氢-1-二醇单硝酸酯(5)：该化合物通过在2-单硝酸异山梨酯的羟基位置转化立体化学分2步制备，使用所述的mitsunobu偶联/脱苯甲酰化协议。(rajput gaikwad et al.2014)得到的1，4：3，6二氢-1-二-醇单硝酸酯总收率为71％，呈蜡状结晶固体；rf＝0.48(60％ea/hept)。
[0222]
1，4：3，6-二氢-1-二醇单硝酸三酯(6)：160mg(5)溶解于二氯甲烷(10ml)中，然后溶解于吡啶(75mg，0.95mmol)中。将溶液在氮气和三氟甲烷磺酸酐下冷却至0℃，搅拌下逐滴添加，然后加热至室温并搅拌过夜。通过硅藻土过滤溶液并用冷二氯甲烷冲洗，蒸发，然后通过柱层析(12g isco)纯化，用ea/庚烷(0-50％)洗脱，以获得含有236mg，87％的1，4：3，6-二氢-1-二醇单硝酸三酯(化合物6)的透明状产物；rf＝0.80(40％ea/hept)。
[0223]
将(3s，3as，6r，6ar)-6-((3-(2-((叔丁基二苯基硅基)氧基)乙酰胺基)丙基)氨基)六氢呋喃[3，2-b]呋喃-3-基硝酸酯(7)：1，4：3，6-二氢-1-二醇单硝酸酯三酯(6)(84mg，0.26mmol)与中间体4(193mg，0.52mmol)以1ml二氧六环溶液结合。在100℃下在氮气流下搅拌混合物，使溶剂蒸发。2小时后，溶剂完全蒸发，混合物从透明黄变为红橙糊状。将反应混合物冷却至室温，tlc(60％乙酸乙酯/庚烷)表明反应完全。粗产品通过柱层析(12g isco)纯化，用meoh/dcm(5-20％)洗脱，得到(7)，为油状物(90mg，64％)；rf＝0.60(15％meoh/ea)。
[0224]
(3s，3as，6r，6ar)-6-((3-(2-羟基乙酰氨基)丙基)氨基)六氢呋喃[3，2-b]呋喃-3-基硝酸酯(cr-0305)：在氮气下将中间体(7)(80mg，0.15mmol)溶解于无水thf(5ml)中，并在室温下逐滴添加tbaf溶液(10m in thf，190μl，0.19mmol)。2小时后，tlc(10％meoh/dcmw/cam染)显示完全反应。蒸发溶剂，并通过柱层析(4gisco)纯化粗产物，用meoh/dcm(1-20％)洗脱，得到油状cr-0305(22mg，49％)；rf＝0.40(10％meoh/dcm)。
[0225]
cr-0202的合成
[0226][0227]
(3s，3as，6r，6ar)-6-((3-氨基-3-氧丙基)氨基)六氢呋喃[3，2-b]呋喃-3-基硝酸酯(cr-0202)：将化合物(6)(100mg，0.31mmol)与3-氨基丙胺(33mg，0.37mmol)混合，作为溶于1ml二恶烷中的溶液。在80℃下在氮气流下搅拌混合物，使溶剂蒸发。2小时后，溶剂完全蒸发，混合物从透明黄变为红橙糊状。将反应混合物冷却至室温，tlc(10％meoh/dcm)表明反应完全。通过柱层析法(4gisco)纯化粗产品，用meoh/dcm(1-20％)洗脱，得到呈泡沫状固体的cr-0202(19mg，23％)；rf＝0.20(10％meoh/dcm)。
[0228]
毒性
[0229]
针对2-硝酸异山梨醇酯、硝酸异山梨醇酯和grl-0617对cr-0305和cr-0202进行了测试，以确定线粒体毒性的证据以及后细胞atp总量的变化，使用的浓度与已知的2-硝酸异山梨醇酯(1-2um)人血清浓度相关。
[0230]
在agilent seahorse xfe96分析仪中进行mitocheck complex i-v活性测定，以确定化合物对分离线粒体中线粒体电子传递链和atp合酶的影响。使用10点1/2log稀释一式四份以及对五种复合物中的每一种复合物的载体阳性对照，以剂量依赖性方式筛选化合物。
[0231]
复合物i的活性是通过测定分离的牛心脏线粒体中复合物i氧化nadh的鱼藤酮敏感率来测定的。为了防止复合物iii氧化泛喹啉，存在kcn(1mm)以抑制下游电子传输链。本试验的阳性对照为鱼藤酮，起始浓度为10um。
[0232]
复合物ii的活性是通过测定分离的牛心脏线粒体中dcpip减少的琥珀酸依赖性比率来测定的。为了防止复合物iii氧化泛醌，以及从复合物ii到复合物i的反向电子转移，所有实验都使用了抗霉素a(10um)、kcn(1mm)和鱼藤酮(1um)。本试验的阳性对照为起始浓度为10mm的2-噻吩酰三氟丙酮(ttfa)。
[0233]
复合物iii的活性是通过测定分离的牛心脏线粒体中电子通过泛醌从复合物ii传递到复合物iii的细胞素c还原速率来测定的。为了防止复合物iv氧化细胞素c，所有实验中都存在kcn(1mm)。该试验的阳性对照为初始浓度为10um的抗霉素a。
[0234]
复合物iv的活性是通过测定分离的牛心脏线粒体中复合物iv的细胞素氧化速率来测定的。该分析的阳性对照为kcn，初始浓度为10mm。
[0235]
使用一种测定nadh还原速率的方法测定复合物v的活性，该方法由一系列与分离的牛心脏线粒体中复合物v水解atp相关联的偶联反应产生。鱼藤酮(1upm)可防止nadh被络合物i氧化。由于未报告抑制作用，因此未筛选非特异性atp酶抑制试验的计数器。该试验的阳性对照物为起始浓度为10um的寡霉素。
[0236]
还进行了线粒体应激试验，以确定实验化合物对细胞线粒体的影响。使用经agilent seahorse xfe96分析仪优化的hmec-1人皮肤内皮细胞进行检测。hmec-1细胞取自atcc，并按照供应商的指南进行培养：完整的细胞培养基包括mcd 131，补充10ng/ml egf 1pg/ml氢化可的松、10mm谷氨酰胺、10％fbs和1％青霉素/链霉素。为了确定最佳细胞接种密度，细胞以80000个细胞/孔的最高浓度接种在agilent xf96细胞培养微孔板中。此后，每行细胞的稀释度为8点2倍(范围＝80000-600个细胞/孔)，细胞在标准条件下培养过夜。优化的标准包括基线耗氧量(ocr)在75到150pmol/min之间，以及fccp浓度将最大限度地增加ocr而不会造成抑制。根据这些滴定，最佳细胞接种密度和fccp浓度为25000个细胞/孔和2mm fccp。在应激试验中，hmec-1细胞以25000个活细胞/孔的速度接种在xfe96细胞培养微板上的完整培养基中，并在37℃/5％co2下培养18小时。使用台盼蓝排除法评估细胞活力。第二天早上，使用agilent bravo自动液体处理器的介质交换程序，将完整的介质交换为xf分析介质(补充有10mm葡萄糖、1mm丙酮酸和2mm谷氨酰胺的xf dmem)。交换培养基后，将细胞板在37℃(非co2)下培养1小时，并使用cytation 5成像多模式板阅读器(biotek仪器)成像，并使用prism 9.0(graphpad软件)进行分析。应激试验曲线在18分钟内循环暴露于1ug/ml的寡霉素、2um fccp和10um抗霉素a/1um鱼藤酮。线粒体应激试验完成后，用seahorse cell analysis软件对细胞成像，并对hoechst阳性细胞核进行量化。使用wave analysis软件(版本2.6.1.53)和prism 9.0(graphpad软件)分析所有数据。所有条件下的最终dmso浓度为0.1％。
[0237]
进行细胞滴定glo-atp发光细胞活性测定(promega cat.#g7571)，以测量化合物的反应中的细胞总atp。使用hmec-1人真皮内皮细胞进行检测。在载体存在的情况下，使用8点1/2对数稀释液对化合物进行筛选，一式两份。在10um、3um、1um、300nm、100nm、30nm、lonm和3nm的cr-0305、cr-0202、硝酸异山梨醇酯和grl-0617三次暴露下培养hmec-1细胞18小时，并使用celltiter发光细胞活性测定法(promega cat.#g7571)测量细胞atp，对照组仅模拟处理溶剂和培养基，与阳性对照药物10mm阿霉素一起服用。
[0238]
cr-0305的毒性通过对分离线粒体的mitocheck复合物i-v活性测定以及使用安捷伦海马xfe96分析仪对hmec-1进行的线粒体应激试验进行检测，然后测量药物对hmec-1atp合成的影响。在10-100um浓度下未发现明显毒性。
[0239]
生物学
[0240]
通过使用带有glide对接的maestro schrodinger suite软件对九个sars-cov-2靶点进行电子建模，对新化合物进行sars-cov-2蛋白的虚拟筛选。(friesner.murphy等人，2006)选择虚拟命中的标准包括对接分数和目标关键结合囊中氨基酸残基内的分子间相互作用。(greenwood.calkins等人，2010)还使用qikprop，schrodinger release 2020-2计算了化合物特性和预测的物理化学adme/tox特性。sars-cov-2靶点包括：主要蛋白酶、3clpro(nsp5)、尖峰糖蛋白、血管紧张素转换酶2、ace2(人类)、rna依赖性rna聚合酶、rdrp(nsp12)、内切核糖核酸酶(nsp1 5)、，鸟嘌呤-n7甲基转移酶(nsp14)、木瓜蛋白酶样蛋白酶、plpro(nsp3)、nsp3的adp核糖磷酸酶和bromodomain2，brd2(人类)。使用maestro蛋白质制备向导选择默认值，分别修改9个靶点的报告结构。杂原子中5a的水分子被消除。用epik在ph值5-9之间修改侧链的质子化状态。(shelley.cholleti等人，2007)在开始之前细化了氢键位置和扭转角，包括添加缺失的侧链。允许存在二硫键。在ph值为7的条件下对水的方
向进行取样。
[0241]
这些蛋白质靶点与59种化合物结构相匹配，其中包括本发明的48种新型化合物结构(见美国专利号10501471和10913748)(术语定义见下文)，以及一种主要血浆代谢物gs-441524和gs-441524三磷酸且对新冠肺炎有效的药物remdesivir(beigel.tomashek等人，2020)，抗病毒药物利巴韦林，plpro抑制剂grl-0617(shin.mukherjee等人，2020年)，硝酸异山梨酯，1，4：3，6-二氢-d-葡萄糖醇，1，6：3，6-双氢-1-二醇，(3s，3as，6r，6ar)-6-氨基六氢呋喃[3，2-b]呋喃-3-基硝酸酯，5-硝酸异山梨醇酯和2-硝酸异山楂酯。
[0242]
当前化合物的命名。目前测试的化合物包括化学式i、ii、iii、iv、v和/或vi的化合物，其中化合物编号如下：
[0243]
a.当r1为
[0244]
1.缺省
[0245]
2.(ch2)2o
[0246]
3.(ch2)2nh
[0247]
4.(ch2)3o
[0248]
5.(ch2)3nh
[0249]
6.ch2c(＝o)o
[0250]
7.ch2c(＝o)nh.
[0251]
b.当r2为
[0252]
1.(ch2)2o
[0253]
2.(ch2)2nh
[0254]
3.(ch2)3o
[0255]
4.(ch2)3nh
[0256]
5.ch2c(＝o)o
[0257]
6.ch2c(＝o)nh
[0258]
7.ch2oc(＝o)o
[0259]
8.ch2oc(＝o)nh
[0260]
9.ch2nhc(＝o)o
[0261]
10.ch2nhc(＝o)nh
[0262]
cr-xyy编号方案基于xx＝化学式编号，yy＝与化学式编号相关联的r1或r2组编号。因此，化合物iii-5是从化学式iii中创建的，具有第五个r1基团，命名为cr-0305。
[0263]
控制化合物包括在每个sars-cov-2目标的glide对接作业中，如下所示：
[0264]
·
主要蛋白酶(3clpro)：洛皮那韦、博塞普韦韦和α-酮酰胺，
[0265]
·
尖峰糖蛋白和ace2(人)：双胺糖
[0266]
·
rdrp(nsp12)：利巴韦林
[0267]
·
内切核糖核酸酶(nsp15)和鸟嘌呤-n7甲基转移酶(nsp14)：病毒唑
[0268]
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plpro(nsp3)：gsk2251052盐酸盐
[0269]
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nsp3的adp核糖磷酸酶：adp核糖酶
[0270]
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brd2(人类)：jq1和pfi1
[0271]
针对高性能配体受体对接，选择刚性对接(glide，schrodinger suite)作为化合
物对9个sars-cov-2蛋白靶点亲和力的筛选模型。这些对接参照中未考虑任何约束(偏差较小的模型)。根据最近报道的这些靶点的结构，结合囊和化合物氨基酸残基中的关键分子间氢键以及对接分数是这一硅筛选项目中排名排序化合物的主要驱动因素。成功完成glide工作后，通过glide评分(配体亲和力预测)评估每个化合物的对接实验姿势。当它模拟结合自由能时，负值越大，结合越紧密。其次，他们通过emodel评分进行评估，这是一种姿势强度和有效性的测量方法。
[0272]
一些化合物被鉴定为具有强大的指标，对一些蛋白质如plpro(nsp3)(图1a-d)和nsp3的adp核糖磷酸酶，其性能优于对照化合物和现有批准药物。(图2a-d)显然，新化合物在这两个位置以特定的亲和力作用于nsp3，表明它们对nsp3具有重要作用，可能抑制病毒复制，同时阻止固有免疫反应的plpro拮抗。(baez santos st john等人，2015年)对于其余靶点，最高命中得分要么与对照化合物相似(如3clpro、spike糖蛋白、rdrp、nsp15和brd2)，要么略低于对照化合物(如ace2和nsp3的鸟嘌呤-n7甲基转移酶)。对于pl
pro
，约有10种得分高于和/或等于对照化合物(gsk2251052盐酸盐、雷德西韦、利巴韦林、rtp)的化合物被确定为强命中：如cr-0305、cr-0607、cr-0510和cr-0201。对它们在催化囊内的结合相互作用进行了进一步评估。对于adp核糖磷酸酶，与对照化合物(adp核糖酶，酶底物)相比，大约有6种化合物得分相等，如cr-0504、cr-0502、cr-0501、cr-0606、cr-0203和cr-0510。根据生成的plpro对接模型，cr-0305、cr-007和cr-05010化合物结合在酶的活性部位，类似于利巴韦林。(wu.liu等人，2020年)预测了glyl63、aspl64、gly271、tyr264和化合物之间的关键氢键。顶部点击与酶之间的这些相互作用表明这些化合物对pl
pro
具有强大的抑制作用。
[0273]
与其他已知抗病毒药物相比，目前的新型药物似乎与nsp3的plpro和adp核糖磷酸酶结构域结合的亲和力增强(lei，kusov等人，2018)，同时将no靶向传递给新冠肺炎中的sars-cov-2病毒。显然，新型化合物在这两个位置以特定亲和力作用于nsp3，表明它们对nsp3具有重要功能，可能抑制病毒复制，同时阻止固有免疫反应的plpro拮抗。cr-0305在结合plpro方面优于grl-0617、remdesivir、gs-441524、lopinavir、boceprevir和ribavirin。cr-0305与其他抗病毒药物相比，似乎对sars-cov-2具有更高的亲和力，因为它牢固地位于plpro催化囊中，并与关键催化囊氨基酸glyl63、aspl64、g1y271和tyr264进行最关键的相互作用。总之，有十种化合物作为配体与plpro的亲和力得分高于和/或等于对照化合物(gsk2251052盐酸盐、雷德西韦、利巴韦林、rtp、grl-0617)，其中一些被鉴定为强命中：如cr-0305、cr-0607、cr-0519和cr-0201。然后，通过分子力学/广义玻恩表面积(mm/gbsa)计算，使用schrodinger suite prime软件包对这些命中进行排名，以预测命中化合物的结合自由能，提供更好的富集度，并按化合物的对接姿势进行排名。表a汇总了分数。
[0274]
表a：与pl
pro
结合的化合物
[0275]
[0276]
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[0278][0279]
对于adp核糖磷酸酶，与对照化合物(adp核糖酶、酶底物)相比，大约有6种化合物得分相等，如cr-0504、cr-0502、cr-0501、cr-050.6、cr-0201和cr-0510。对于其余靶点，顶级命中得分要么与对照化合物(如3clpro、spike糖蛋白、rdrp、nsp15和brd2)非常相似，要么略低于对照化合物(例如nsp3的ace2和鸟嘌呤-n7甲基转移酶)。与对照组相比，glide和emodel分数较低主要是由于一些化合物的尺寸较小。例如，3clpro和spike受体结合域(rbd)结合位点较大，靠近表面且暴露在溶剂中，需要较大的化合物才能完全嵌入囊中。表b中汇总的分数。
[0280]
表b：与adp核糖磷酸酶结合的化合物
[0281]
[0282]
[0283][0284]
利用sars-cov-2pl
pro
(6wuu pdb id)的晶体结构研究md(分子动力学)，我们进行了20+ns模拟，以确认小分子和蛋白质结合囊接触和水网络的稳定性。(hollingsworth and dror 2018)根据cr-0305化合物的md模拟结果，与参考相比，在残基110-113周围的化合物/蛋白质之间观察到额外接触。
[0285]
(图3a)和(图3b)：这些图提供了(图3a)cr-0305和(图3g)grl-0617与催化位点中的pl
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蛋白残基的详细配体原子相互作用的示意图。显示了在选定轨迹中超过30％的模拟时间(0到20ns)发生的交互。水网络定义在-oh和活性中心(cys-111)之间，具有超过87％的接触强度(cr-0605、cr-0202或grl-0617未见)，这将cr-0305定义为所研究的化合物中可以提供最高能量和最稳定pl
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结合的化合物。
[0286]
(图4a和图4b)：与pl
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活性位点残基(或“接触物”)的蛋白质配体相互作用分为四种类型：氢键、疏水、离子和水桥。与(图4b)grl-0617相比，pl
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的催化位置处的相互作用主要取决于半胱氨酸-111和cr-0305(图4a)与pl
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之间的水桥，证明这是其区别特征。(图4c)和(图4d)：均方根偏差(rmsd)用于测量特定框架相对于参考框架的选定原子位移的平均变化。大于1-3a的变化表明蛋白质在模拟过程中发生了较大的构象变化。随着时间的推移，cr-0305(图4c)与pl
pro
催化位点的结合比grl-0617(图4d)的结合更稳定。
[0287]
根据上述教导，本发明的许多修改和变型是可能的。因此，应当理解，在所附权利要求的范围内，本发明可以按照本文中具体描述的方式以外的方式实施。
[0288]
参考文献列表
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尿素类似物通过尿素转运蛋白ut-b的转运效率比较.
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技术特征：

1.一种传染病的方法，包括：向有需要的哺乳动物施用有效量的化学式i、ii、iii、iv、v或vi的化合物，其中：化合物选自化学式i、ii、iii、iv、v和vi，其中，r1空缺；或者，r1选自(ch2)2o、(ch2)2nh，、(ch2)3o、(ch2)3nh、ch2c(＝o)o以及ch2c(＝o)nh中的一种；以及r2选自(ch2)2o、(ch2)2nh、(ch2)3o、(ch2)3nh、ch2c(＝o)o、ch2c(＝o)nh、ch2oc(＝o)o、ch2oc(＝o)nh、ch2nhc(＝o)o以及ch2nhc(＝o)nh中的一种；或其药学上可接受的盐。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病导致患者细胞缺氧。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病是由病毒、细菌、分枝杆菌、寄生虫、真菌或其组合引起的。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病是由选自sars-cov、mers cov、
sars-cov-2、a型流感、b型流感、c型流感、痘苗病毒、单纯疱疹病毒-1、epstein-barr病毒和coxsackie病毒的病毒引起的。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病为covid-19。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病是由链球菌、大肠杆菌、粘质沙雷菌、核粒梭状杆菌、表皮葡萄球菌、杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、艰难梭菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏杆菌和产气荚膜梭菌中的一种细菌引起的。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病是由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和细胞内分枝杆菌以及麻风分枝杆菌中的一种分枝杆菌引起的。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病是由选自克氏锥虫病、曼氏血吸虫、弓形虫、恶性疟原虫、大型利什曼原虫、卡斯特拉尼棘阿米巴和粪类圆线虫中的一种寄生虫引起的。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病是由选自体癣和白念珠菌的真菌引起的。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，化合物为化学式i或iv或其药学上可接受的盐。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，r1空缺。12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，r1选自(ch2)2o、(ch2)2nh、(ch2)3o、以及(ch2)3nh中的一种。13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，r1为(ch2)2o。14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，r1为(ch2)2nh。15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，r1为ch2c(＝o)o。16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，r1为ch2c(＝o)nh。17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，化合物为化学式ii或v或其药学上可接受的盐。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，r2选自(ch2)2o、(ch2)2nh、(ch2)3o、(ch2)3nh、ch2oc(＝o)o、ch2oc(＝o)nh、ch2nhc(＝o)o以及ch2nhc(＝o)nh中的一种。19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，r2为ch2c(＝o)o。20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，r2为ch2c(＝o)nh。21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，化合物为化学式iii或vi或其药学上可接受的盐。22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，r1空缺。23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，r1选自(ch2)2o、(ch2)2nh、(ch2)3o和(ch2)3nh中的一种。24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，r1为ch2c(＝o)o。25.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，r1为ch2c(＝o)nh。

技术总结

本发明提供了使用一氧化氮供体化合物传染病的新方法，例如新冠肺炎。例如新冠肺炎。例如新冠肺炎。

技术研发人员：

约翰

受保护的技术使用者：

约翰

技术研发日：

2021.03.27

技术公布日：

2022/12/12