一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法与流程

1.本发明属于生物分离提纯技术领域，具体的说，涉及一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法。

背景技术：

2.微藻细胞作为一种在自然界水环境中分步比较广泛且微小的浮游植物，同时也是地球上代谢功能最为多样化的生物类之一，微藻细胞在进行生命光合与呼吸生理作用时，将机体的能量转化成高附加值的次生代谢产物，例如藻蓝蛋白、藻多糖、藻油酯、内源素等高附加值的产物。近20年国内外高校及科研院所的研究共同发现：其中的微藻细胞内源素具有非常强大的生物功效性，被美誉为“彩黄金、可以食用的钻石”，它具有的生物活性和抗氧化性是其他药材和食物无法比拟和抗衡的，是它们的成百上千倍，其在食品、药品、保健品、化妆品、饲料等领域应用越来越广。
3.近几年国内外微藻产业进入迅猛的发展进程，但微藻产业发展主要集中在农业级种养模式方面，还只能一直依赖农产品级鲜藻或干粉等初级加工品售卖，导致出现养殖规模宏大而效益偏低的产业通病，高附加值的内源素产品精深化开发落后，出现零星的开发还依靠昂贵的高压设施设备进行研磨破碎，强酸强碱辅助处理，分离提取还依赖消耗大量的有毒有害的化学溶剂，导致重金属、塑化剂、苯并芘等副产物不断涌现，溶剂残留居高不下，不合格品屡见不鲜，素与油酯无法分离，产品纯度偏低，生物功效性差，目前开发转化还处于油酯和素混合应用，转化率偏低，成本高，流动性和稳定性差，产品质量参差不齐，因此国内外市场上对高含量的微藻内源素产品需求空间还一直无法满足。所以如何尽快实现工业化分离提纯加工处理微藻细胞的内源素，将是促使农业资源化向精深产业化突破与延伸的关键所在，也是目前和未来整个产业关心和关注的核心方向，也将成为关乎微藻资源转化成微藻经济的重要桥梁和纽带。

技术实现要素：

4.为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，具有操作简单、耗能小、成本低、转移率高、流动性好、无毒环保的综合性优势。
5.为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：所述的从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法包括以下步骤：1）将鲜活微藻细胞投入到含有盐卤水的管道式超声波处理器中进行质壁分离处理，然后离心分离并清洗除掉盐卤水，得到鲜藻膏。选用的鲜活微藻细胞富含内源素、体型庞大厚实、内源素稳定、滋味醇厚。
6.2）将鲜藻膏加入到乳化剂中乳化浸泡，把鲜藻细胞游离脂肪酸酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯、磷酸酯、内源素酯等都全部乳化成水溶解产物，然后将乳化溶液再次打入管道式超声波处理器内进行负压和空化处理，促进胞内水溶解物溶出胞外，然后通过超高速离
心机离心作用将细胞内残留物质完全甩细胞外，并过滤收集滤液。高速离心机可以选用管道式离心机、平板离心机、三足离心机和蝶式离心机。
7.3）将滤液减压真空浓缩，生成含有5%~20%内源素的油树脂混合物。减压浓缩可以选用冷冻真空浓缩设备、高温旋转真空浓缩设备和球型高温真空浓缩设备其中的一种或几种搭配组合。
8.1）4）将内源素油树脂混合物溶解在caco
3-h3bo3溶液中，并加入一定酶活单位的脂肪酶溶液，每间隔10min振荡一次，形成均匀一致的水解混合物，有效地解离各种酯类，形成水溶性的产物，如脂肪酸单脂、甘油，释放出其中包含的水不溶性内源素产物，其中水不溶性内源素可以是：叶黄素、胡萝卜素（α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素）、藻青素、虾青素、玉米黄素的一种或几种的混合物。
9.5）加入氯化钠溶液，离心分离得水溶性产物和水不溶性内源素产物；6）用70~90℃的纯化水8~12倍量对内源素产物进行清洗，进一步纯化内源素产物，清洗完成后对内源素产物进行干燥，制成含水率小于0.5%的干燥物，纯度提升至75~95%。其中对内源素的干燥法可为热风干燥、冷冻干燥、微波干燥、辐射干燥等，优选冷冻干燥法，可有效避免内源素高温被氧化。
10.进一步地，步骤1）所述鲜活微藻细胞为螺旋藻、雨生红球藻、盐藻和小球藻其中一种或多种。
11.进一步地，步骤1）所述盐卤水为氯化钠、硫酸铵、氯化钙和硫酸钙中的一种或几种搭配使用，使用浓度为20%~30%。
12.进一步地，步骤1）所述鲜活微藻细胞投入到含有盐卤水的管道式超声波处理器进行质壁分离处理，超声处理时间为10~60min，超声波频率4000hz，温度25~60℃，优选35~45℃。
13.进一步地，步骤2）所述乳化剂包括改性大豆磷脂、甘油-酯及其衍生物、硬脂酰乳酰乳酸盐、丙二醇硬脂酸-酯、聚甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖脂肪酸酯、卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、阿拉伯胶，蜂胶、果胶和海藻酸钠其中的一种或几种，用量为1
‰
~3
‰
，优选改性磷脂和单硬脂酸甘油酯，浸泡时间10~30min，温度为60~95℃，优选75~85℃。
14.进一步地，步骤2）所述将乳化溶液打入管道式超声波处理器内进行负压和空化处理，超声处理时间为10~60min，超声频率为4000hz，温度为35~55℃，优选45~50℃。
15.进一步地，步骤4）所述caco
3-h3bo3溶液ph值为7.5~10.5，优选9.5~10.0浓度为0.1mol/l，在此条件下，酶可以保持比较高的活性和稳定性。
16.进一步地，步骤4）所述脂肪酶溶液酶的活力单位为100u~2000u,优选500u~800u。其中脂肪酶又称为三酰基甘油酰基水解酶，脂肪酶可以是动物胰腺酶、胆固醇脂酶、角质酶、根霉脂肪酶或假丝酵母脂肪酶。
17.进一步地，步骤4）加入脂肪酶溶液后温度控制在35~55℃，酶解时间为30~60min。
18.进一步地，步骤5）所述氯化钠溶液为食品级，浓度为1%~10%。
19.本发明的有益效果：1、本发明采用鲜活微藻细胞，有效保留内源素的天然完整性和和纯洁性，与加工成干粉然后才进行加工相比，可以节约30%的干燥成本费，而且避免干燥后因细胞内部严重干瘪萎缩，导致提取率偏低，无法彻底提取完全。
20.2、本发明采用盐卤和超声复合法对鲜微藻细胞进行深度质壁分离，打通细胞内部与外界的通道，促进油脂和内源素的渗透和外溢，与目前工业上所采用的大型超高压设施设备或强酸强碱腐蚀相比，本发明成本低，对环境友好，更容易推广和使用。
21.3、本发明采用脂肪酶水解内源素，条件温和，容易控制，水解彻底，不会产生副产物，在产品中无食品安全问题；用水作为溶剂，避免化学溶剂带来的溶剂残留和污染，避免副产物的出现。
22.4、本发明将内源素与油树脂有效分离，将内源素纯度从原来的10%提升至80%，剔除大量油树脂，节约运送成本，迎合了市场对降脂减肥原料的苛刻要求，是目前市场上内源素油树脂混合物无法满足的产品。
附图说明
23.图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
25.实施例1一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法包括以下步骤：1）称取25g氯化钠溶解于100g纯化水中备用,再取鲜活雨生红球藻100g，含水率为75%，内源素为虾青素，虾青素含量为2.5%，把鲜活雨生红球藻加入到盐卤溶液中并搅拌均匀，然后投入到管道式超声波发生器内，超声处理时间为30分钟，超声波频率4000hz，温度40℃，然后通过机械离心分离盐卤水，再用加纯化水清除掉氯化钠的残留物。
26.2）加入改性大豆磷脂和单硬脂酸甘油酯乳化剂配合使用加温乳化浸泡，用量为2.5
‰
，两种乳化剂比例3:1，搅拌乳化时间20分钟，温度80℃，然后通过超高速离心将含内源素和其它油酯从细胞内腔中甩脱离心出，过滤并收集离心后溶液。
27.3）将滤液进行真空减压浓缩成含有内源虾青素素8%的油树脂混合物6.5g。
28.4）把含内源虾青素素的油树脂混合物溶解在ph为9.5且浓度为0.1moll的caco
3-h3bo3溶液中，并加入500u酶活单位胆固醇脂酶脂肪酶溶液，温度控制在37℃，酶解55min，每间隔10min振荡数秒，最后形成均匀一致的水解混合物，有效地解离各种酯类，形成水溶性的产物，并释放出其中包含的水不溶性内源素产物虾青素。
29.5）加入2.5%食品级氯化钠溶液促进水溶性产物和内源素产物虾青素破乳分层加速分层，并通过离心将水溶性产物和虾青素产物分离。
30.6）用80℃纯化水12倍量对虾青素产物进行清洗，进一步纯化虾青素产物，最后对虾青素产物进行冷冻干燥，制成含水率小于0.1%的干燥物0.5g，虾青素纯度提升至80%。
31.实施例2一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法包括以下步骤：1）称取30g氯化钠溶解于100g纯化水中备用,再取鲜活雨生红球藻100g，含水率为70%，内源素为虾青素，虾青素含量为4.0%，把鲜活雨生红球藻加入到盐卤溶液中并搅拌均匀，然后投入到管道式超声波发生器内，超声处理时间为30分钟，超声波频率4000hz，温
度40℃，然后通过机械离心分离盐卤水，再用加纯化水清除掉氯化钠的残留物。
32.2）加入改性大豆磷脂和单硬脂酸甘油酯乳化剂配合使用加温乳化浸泡，用量为2.5
‰
，两种乳化剂比例3:1，搅拌乳化时间20分钟，温度80℃，然后通过超高速离心将含内源素和其它油酯从细胞内腔中甩脱离心出，过滤并收集离心后溶液。
33.3）将滤液进行真空减压浓缩成含有内源虾青素素12%的油树脂混合物9.0g。
34.4）把含内源虾青素素的油树脂混合物溶解在ph为9.5且浓度为0.1moll的caco
3-h3bo3溶液中，并加入500u酶活单位胆固醇脂酶脂肪酶溶液，温度控制在37℃，酶解55min，每间隔10min振荡数秒，最后形成均匀一致的水解混合物，有效地解离各种酯类，形成水溶性的产物，并释放出其中包含的水不溶性内源素产物虾青素。
35.5）加入3%食品级氯化钠溶液促进水溶性产物和内源素产物虾青素破乳分层加速分层，并通过离心将水溶性产物和虾青素产物分离。
36.6）用85℃纯化水10倍量对虾青素产物进行清洗，进一步纯化虾青素产物，最后对虾青素产物进行冷冻干燥，制成含水率小于0.1%的干燥物1.1g，虾青素纯度提升至85%。
37.实施例3一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法包括以下步骤：1）称取35g氯化钠溶解于100g纯化水中备用,再取鲜活雨盐藻100g，含水率为70%，内源素为β—胡萝卜素，β—胡萝卜素含量为7.5%，把鲜活盐藻加入到盐卤溶液中并搅拌均匀，然后投入到管道式超声波发生器内，超声处理时间为30分钟，超声波频率4000hz，温度45℃，然后通过机械离心分离盐卤水，再用加纯化水清除掉氯化钠的残留物。
38.2）加入改性大豆磷脂和单硬脂酸甘油酯乳化剂配合使用加温乳化浸泡，用量为2.8
‰
，两种乳化剂比例3:1，搅拌乳化时间20分钟，温度85℃，然后通过超高速离心将含内源素和其它油酯从细胞内腔中甩脱离心出，过滤并收集离心后溶液。
39.3）将滤液进行真空减压浓缩成含有内源β—胡萝卜素16%的油树脂混合物12g。
40.4）把含β—胡萝卜素的油树脂混合物溶解在ph为10.0且浓度为0.1moll的caco
3-h3bo3溶液中，并加入600u酶活单位假丝酵母脂肪酶溶液，温度控制在40℃，酶解60min，每间隔10min振荡数秒，最后形成均匀一致的水解混合物，有效地解离各种酯类，形成水溶性的产物，并释放出其中包含的水不溶性内源素产物β—胡萝卜素。
41.5）加入3.5%食品级氯化钠溶液促进水溶性产物和内源素产物β—胡萝卜素破乳分层加速分层，并通过离心将水溶性产物和β—胡萝卜素产物分离。
42.6）用80℃纯化水10倍量对β—胡萝卜素产物进行清洗，进一步纯化β—胡萝卜素产物，最后对β—胡萝卜素产物进行冷冻干燥，制成含水率小于0.1%的干燥物1.54g，虾青素纯度提升至88%。
43.本发明具有操作简单、耗能小、成本低、转移率高、流动性好、无毒环保的综合性优势，有效将内源素纯度从原来的10%提升至80%以上，剔除大量油树脂，节约运送成本，功效性和应用性面临更加广阔的空间。
44.最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1）将鲜活微藻细胞盐卤水中进行质壁分离处理，然后离心分离清洗除掉盐卤水，得到鲜藻膏；2）将鲜藻膏加入到乳化剂中乳化浸泡，然后将乳化溶液进行负压和空化处理后进行离心分离，并收集滤液；3）将滤液减压真空浓缩，生成含有5%~20%内源素的油树脂混合物；4）将内源素油树脂混合物溶解在caco
3-h3bo3溶液中，并加入一定酶活单位的脂肪酶溶液，每间隔10min振荡一次；5）加入氯化钠溶液，离心分离得水溶性产物和水不溶性内源素产物；6）用纯化水对内源素产物进行清洗，清洗完成后对内源素产物进行干燥，制成含水率小于0.5%的干燥物。2.根据权利要求1所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤1）所述鲜活微藻细胞为螺旋藻、雨生红球藻、盐藻和小球藻其中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤1）所述盐卤水为氯化钠、硫酸铵、氯化钙和硫酸钙中的一种或几种搭配使用，使用浓度为20%~30%。4.根据权利要求1所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤1）所述鲜活微藻细胞投入到含有盐卤水的管道式超声波处理器进行质壁分离处理，超声处理时间为10~60min，超声波频率4000hz，温度25~60℃。5.根据权利要求1所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤2）所述乳化剂包括改性大豆磷脂、甘油-酯及其衍生物、硬脂酰乳酰乳酸盐、丙二醇硬脂酸-酯、聚甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖脂肪酸酯、卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、阿拉伯胶，蜂胶、果胶和海藻酸钠其中的一种或几种，用量为1
‰
~3
‰
，浸泡时间10~30min，温度为60~95℃。6.根据权利要求1所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤2）所述将乳化溶液打入管道式超声波处理器内进行负压和空化处理，超声处理时间为10~60min，超声频率为4000hz，温度为35~55℃。7.根据权利要求1所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤4）所述caco
3-h3bo3溶液ph值为7.5~10.5，浓度为0.1mol/l。8.根据权利要求1所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤4）所述酶活单位脂肪酶溶液酶的活力单位为100u~2000u,优选500u~800u。9.根据权利要求1或8所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤4）加入酶活单位脂肪酶溶液后温度控制在35~55℃，酶解时间为30~60min。10.根据权利要求1所述的一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，其特征在于：步骤5）所述氯化钠溶液为食品级，浓度为1%~10%。

技术总结

本发明涉及一种从鲜活微藻细胞中分离提纯内源素的方法，属于生物分离提纯技术领域，本发明包括以下步骤：1）将鲜活微藻细胞投入到盐卤水中进行质壁分离处理，离心并清洗除掉盐卤水；2）将鲜藻膏加入到乳化剂中乳化浸泡，并进行负压和空化处理后进行离心分离，并收集滤液；3）将滤液减压真空浓缩；4）将内源素油树脂混合物溶解在CaCO