周 薇 韩 江 赵秀丽 万振洲通信作者 泰州市第四人民医院检验科 江苏泰州 225300
魏赵延 江苏正大天创生物工程有限公司 江苏泰州 225300
摘 要：利用免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式，依据双抗体夹心原理，制备N末端脑利钠肽前体免疫层析试纸条；并从灵敏度、特异性、精密度、稳定性等方面进行全面的方法学评价。利用免疫荧光层析法建立N末端脑利钠肽前体试剂盒，并对试剂盒 的各项指标进行评价，建立一种能够定量检测血清N末端脑利钠肽前体的荧光微球免疫层析方法，用于评估心力衰竭，并对试纸条进行
性能评估。结果表明，试剂盒的线性范围为30-35000…ng/l，线性相关系数r≥0.9900，检出限不高于30ng/l，重复性检测结果的变异系数CV≤10%，批间差检测结果的变异系数CV≤15%，试剂盒特异性高，有效期大于24个月。免疫荧光层析法能有效地检测血清中N末端脑利钠肽前体的含量，该方法稳定性好，具有良好的应用前景。
关键词：N末端脑利钠肽前体 定量检测 免疫荧光层析法
N末端脑利钠肽前体是心室受到牵张时心室肌细胞合成和分泌的肽，心室首先合成一种由108个氨基酸组成的脑利钠肽前体（proBNP），proBNP在释放到血液之前降解为有活性的脑利钠肽（BNP）和无活性的NT-proBNP，它在多种病理状态下都会升高，尤其是在循环血量增加致室壁张力增高以及NT-proBNP清除减少的情况下。与BNP相比，NT-proBNP半衰期更长（60-120min），更稳定（常温下血标本可放置72h），操作的重复性好，检测早期和(或)轻度心力衰竭时的敏感性更高。由于NT-proBNP浓度可反映短暂时间内新合成的而不是贮存的BNP释放，因此更能反映BNP通路的激活。大量证据表明，血浆NT-proBNP水平随心力衰竭程度的加重而升高。目前已成为诊断心力衰竭的重要指标之一。
本文中采用免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式制备了能定量检测N末端脑利钠肽前体的免疫荧光层析试纸条，兼具胶体金试纸条与荧光标记技术检测的优点，能够方便携带、即时检测且灵敏度高，便于在基层医院进行推广。
1材料和仪器
N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）抗原、标记抗体N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）单克隆抗体、捕获抗体N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）单克隆抗体购自海肽生物科技（上海）有限公司，羊抗鼠IgG多克隆抗体购自杭州博茵生物，硝酸纤维素膜（包被垫）、玻璃纤维素膜（标记物垫）、吸水纸、PVC底板购自上海捷宁生物，EuropiumChelate微球购自Bangs/深圳市纽邦生物科技有限公司，
各类缓冲液（包括样品垫处理液、封闭液、保存液、复溶液、划膜稀释液等）试剂均为国产分析纯，HM3030型三维划膜喷金仪购自上海金标生物科技有限公司，干式荧光免疫分析仪为苏州和迈精密仪器有限公司，对照N末端脑钠肽前体检测试剂盒(免疫荧光法)购自瑞莱生物科技江苏有限公司。
2方法
2.1…荧光微球标记物的制备
样品垫预处理：用XYZ三维划膜喷金仪将样品垫处理液喷于玻璃纤维长条上，喷量为4…μL/cm，喷后将玻璃纤维放置于烘箱内，干燥温度37…℃，过夜干燥。取0.2μm微球800uL加入80…mg…NHS和80…mg…EDC，室温反应30min，置于冷冻离心机中14000rpm，4℃，离心10min，弃上清。加入8ml…MES…溶液复溶沉淀。
加入800…μg标记抗体N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）单克隆抗体，反应2h以上。加入400…μL…BSA封闭液，反应1h以上。14…000…r/min，4…℃，离心10…min，弃上清，加入800…μL…0.01mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.4）复溶沉淀，4…℃保存。然后用荧光微球标记的N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）单克隆抗体溶液喷涂经预处理的样品垫，喷量为2μL/cm，喷后将样品垫放置于烘箱内，干燥温度37…℃，过夜干燥，干燥结束后，收集密封保存。
2.2…膜处理
将另一株捕获抗体N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）单克隆抗体用磷酸盐缓冲溶液进行稀释，用划膜喷金仪在NC膜上按照2mg/ mL的浓度进行划膜。羊抗鼠IgG多克隆抗体用磷酸盐缓冲溶液进行稀释，用划膜喷金仪在NC膜上按照1mg/mL的浓度进行划膜，含有捕获抗体N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）单克隆抗体的作为检测线（T线），含有羊抗鼠多克隆抗体的作为质控线（C线），然后在37…℃，湿度＜30%的环境下过夜干燥，待用。
2.3…组装
将样品垫、制备标记垫、制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，切裁制得宽3～5…mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
3性能评估
3.1…灵敏度实验
取N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）抗原稀释配制不同浓度的企业准确度参考品（15ng/、30ng/l、100ng/l、300ng/l、875ng/l、1750ng/l、4375ng/l、8750ng/l、17500ng/l、35000ng/l…），用制备的N末端脑利钠肽前体试纸条进行依次测定，每个浓度重复5次，以0…ng/l作为空白对照。以N末端脑利钠肽前体浓度为横坐标，荧光读数仪检测信号为纵坐标，建立标准曲线。
3.2…精密度
抽取3个批次的N末端脑利钠肽前体检测试纸条，分别用浓度为100ng/l（±10%）、1000…ng/l（±10%）、10000ng/l（±10%）的企业质控品进行检测，每个浓度点平行测定10次，计算3个批号检测试纸条的批内变异系数和批间变异系数。
3.3…稳定性
将成品试剂条放置在干燥的库房中保存，每个月测试浓度为100ng/l（±10%）、1000…ng/l（±10%）、10000ng/l（±10%）的企业准确度参考品，测试期为25个月。
4结果与分析
4.1…灵敏度
抽取3个批次的N末端脑利钠肽前体检测试纸条，分别对浓度用15ng/、30ng/l、100ng/l、300ng/l、875ng/l、1750ng/l、4375ng/ l、8750ng/l、17500ng/l、35000ng/l 的企业准确度参考品进行检测，本试剂盒对15ng/的样品可以部分检出，对30ng/l的样品全部检出，其最低检出限≤30ng/l。由图1看出，在30-35000 ng/l的范围具有良好的线性，线性相关系数r≥0.9900，T线颜的深浅与样品中N 末端脑利钠肽前体浓度成正比。
4.2…精密度
抽取3个批次的N末端脑利钠肽前体荧光微球免疫分析试纸条，分别用浓度为100ng/l（±10%）、1000…ng/l（±10%）、
基金项目：泰州市第五期“311工程”第二层次培养对象资助科研项目（TZ2020015）
·48·检测线荧光强度/
控制线荧光强度
N末端脑利钠肽前体企业准确度参考品浓度（ng/l）
图1 标准曲线
表３ 1012.8 ng/l NT-proBNP参考品
保存时间编号第0月第3月第6月第9月第12月第13月第18月第24月第25月卡1/（ng/l）1014.610151047.2999.4995.11024.61014.71056.31041.9相对偏差0.2%0.2% 3.4%-1.3%-1.7% 1.2
%0.2% 4.3% 2.9%卡2/（ng/l）1009.4995.11005.81057.91052.61027.91012.81012.51017.3相对偏差-0.3%-1.7%-0.7% 4.5% 3.9% 1.5%0.0%0.0%0.4%卡3/（ng/l）1058.91020.11008.91009.91025.9994.41023.8996.31047相对偏差
4.6%
0.7%
-0.4%
-0.3%
1.3%
-1.8%
1.1%
-1.6%
3.4%
表４ 10239.2ng/l NT-proBNP参考品
保存时间编号第0月第3月第6月第9月第12月第13月第18月第24月第25月卡1/（ng/l）10591108311016299111079710414102721072110650相对偏差 3.4% 5.8%-0.8%-3.2% 5.4% 1.7%0.3% 4.7% 4.0%卡2/（ng/l）10307108361037310347995110072101841004910472相对偏差0.7% 5.8% 1.3% 1.1%-2.8%-1.6%-0.5%-1.9% 2.3%卡3/（ng/l）10529992110147102321089910376103541044810278相对偏差
2.8%
-3.1%
-0.9%
-0.1%
6.4%
生活垃圾处理器
1.3%
1.1%
2.0%
upd
0.4%
10000…ng/l（±10%）企业质控品进行检测，从表1中可以看出批间和批内变异系数均≤10%，说明N末端脑利钠肽前体荧光免疫试纸条的精密度较高。
4.3…稳定性
永磁电机设计
N末端脑利钠肽前体免疫荧光层析试纸条稳定性测试结果如表2至表３所示所示，在25个月内检测的浓度为100ng/l（±10%）、1000…ng/l（±10%）、10000ng/l（±10%）的企业准确度参考品，各浓度参考品的测定结果的相对偏差均小于15%，表明该N末端脑利钠肽前体试纸条有较好的稳定性，该产品有效期大于24个月。
5讨论
N末端脑利钠肽前体检测在临床上的应用极具意义，N末端脑利钠肽前体是脑利钠肽（BNP）的同源代谢产物。NT-proBNP无生物学活性且缺乏主动清除机制，其主要经肾脏清除，这可能也是患者血浆中NT-proBNP水平较BNP高出2-10倍的原因，使得BNP比NT-proBNP更有利于心力衰竭的临床诊断。综上所述，N末端脑利钠肽前体在临床诊断中发挥着越来越重要的作用。
本研究以荧光微球作为示踪标记物，成功地建立了一种能够定量检测N末端脑利钠肽前体的荧光微球免疫层析试纸条。在试纸条中设置质控线，可增加检测结果的可靠性，若C线无荧光信号，无论T线有无荧光信号，其结果都视为无效。试纸条的最低检测限最低检出限≤30ng/l，具有较高的精密度。稳定性检测结果表明，连续25个月内检测浓度为100ng/l（±10%）、1000…ng/l（±10%）、10000ng/l（±10%）的企业准确度参考品，各浓度参考品的测定结果的相对偏差均小于15%，表明试剂盒的有效期大于24个月。此外，用该方法检测N末端脑利钠肽前体，成本低且操作简单，能够在社区基层医院中广泛推广，而且还能够满足大型医院内因病患流
表2 试纸条的稳定性分析
102ng/l NT-proBNP参考品
保存时间编号第0月第3月第6月第9月第12月第13月第18月第24月第25月卡1/（ng/l）104.4105.5100.7105.3100.2100.2102.699.5104.5相对偏差 2.4% 3.4%-1.3% 3.2%-1.8%-1.8%0.6%-2.5% 2.5%卡2/（ng/l）100.1103103.999.6105100.4101105.299.4相对偏差-1.9% 1.0% 1.9%-2.4% 2.9%-1.6%-1.0% 3.1%-2.5%卡3/（ng/l）100.9105.1100.8103.4105102.210010399.1相对偏差
-1.1%
3.0%
-1.2%
1.4%
2.9%
城市规划模型0.2%
-2.0%
1.0%
-2.8%
表1 试纸条精密度分析
批次样本浓度/（ng/l）平均值/（ng/l）
标准差变异系数%
1
102102.6 1.83 1.781012.8103818.22 1.7510239.210208203.3 1.992102103.9 1.76 1.691012.8102520.90 2.0410239.210248202.2 1.973102102.2 1.77 1.731012.8101916.99 1.6710239.210201240.5 2.36三批批间
102102.65 2.76 2.691012.810338.490.8210239.2
10429.5
219.91
2.01
（下转21页）
tz15
·21·
表3 革兰阴性菌对抗菌药物的耐药性和敏感性（%）
雷击次数
抗菌药物肺炎克雷伯菌肺炎亚种（10株）鲍曼不动杆菌（6株）大肠埃希菌（5株）铜绿假单胞菌（5株）R S R S R S R S 哌拉西林100.0（10）0.0（0）83.3（5）16.7（1）100.0（5）0.0（0）0.0（0）50.0（1）阿莫西林/克拉维酸62.5（5）12.5（1）100.0（1）0.0（0）80.0（4）0.0（0）
哌拉西林/他唑巴坦70.0（7）20.0（2）83.3（5）16.7（1）0.0（0）100.0（5）0.0（0）80.0（4）头孢唑啉80.0（8）0.0（0）100.0（1）0.0（0）60.0（3）40.0（2）
头孢他啶80.0（8）20.0（2）83.3（5）16.7（1）20.0（1）80.0（4）0.0（0）80.0（4）头孢吡肟100.0（9）0.0（0）83.3（5）16.7（1）40.0（2）60.0（3）0.0（0）80.0（4）氨曲南87.5（7）0.0（0）100.0（2）0.0（0）20.0（1）80.0（4）20.0（1）80.0（4）亚胺培南66.7（6）33.3（3）83.3（5）16.7（1）0.0（0）100.0（5）0.0（0）100.0（5）美洛培南66.7（6）33.3（3）83.3（5）16.7（1）0.0（0）100.0（5）20.0（1）80.0（4）阿米卡星50.0（5）50.0（5）83.3（5）16.7（1）0.0（0）100.0（5）庆大霉素60.0（6）40.0（4）83.3（5）16.7（1）40.0（2）60.0（3）0.0（0）100.0（5）环丙沙星100.0（10）0.0（0）83.3（5）16.7（1）40.0（2）60.0（3）20.0（1）60.0（3）四环素62.5（5）37.5（3）83.3（5）16.7（1）60.0（3）40.0（2）
4讨论
本次研究结合临床病例分析发现，在送检的阳性血培养中可能存在污染菌，这可能与消毒不规范等有
关。因此在抽血时需要严格规范消毒操作，谨记经过消毒后的手和医疗器械不要碰到非消毒区，加强血培养的质量控制，成人采血量控制在每瓶8-10ml，儿童采血量控制在每瓶1-3ml。当出现可疑致病菌时，需要与临床医生进行沟通，联合其他感染指标，如白细胞、降钙素原、C反应蛋白等检测结果，以及体温、临床表现等综合判断是否是致病菌[3-4]。
综上所述，血流感染病原菌复杂，若发现血流感染可疑患者，应及时进行血培养的送检，进而对血培养分离菌株进行检测和耐药性分析，这极有利于医生快速掌握细菌特征，并根据所得的鉴定与药敏结果，结合患者的临床表现及时采用有效的措施，杜绝过量且无效地使用抗菌药物，最终达到理想的结果。
参考文献
[1]胡付品, 郭燕, 朱德妹, 等. 2017年中国CHINET细菌耐药性监测[J]. 中
国感染与化疗杂志, 2018, 18(3): 241-251.
[2]罗婷婷，杨兴祥，龙珊珊，杨仁国.医院获得性大肠埃希菌血流感染的临
床特点及耐药性分析[J].西南军医,2020,22(02):126-130.
[3]楼颂羔，王微，张建松，黄小松.大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌血流感染临
床特征及抗菌效果比较[J].浙江医学,2020,42(05):458-461.
[4]夏飞，秦涛，张明伟，胡光煦，廖亚玲，安薇，陈敏，许鑫，杜鸣.产ESBL大肠
埃希菌致血流感染的临床特征及危险因素分析[J].中国医院药学杂志,2020,40(03):305-309.
量大而需快速检测的要求，是一种临床上检测N末端脑利钠肽前体便捷可靠的方法。
参考文献
[1]SIEGEL R, WARDE, BRAWLEYO, et al. Cancer statistics, 2011: theimpact
of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths [J].
CA Cancer J Clin; 2011; 61(4) : 212-36.
[2] KIM J, LEE Y S, HWANG I K, et al. Postoperative carcinoembryonicantigen
as a complementary tumor marker of carbohydrate antigen19-9 in pancreatic ductal adenocarcinoma [J]. J Korean Med Sci; 2015; 30(3): 259-263.
[3]ALBERTI C. Cytoskeleton structure and dynamic behavior: quick excursus
from basic molecular mechanisms to some implications in cancer chemotherapy [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci; 2009; 13(1): 13-21.
[4]郭明明, 肖华龙, 周剑波, 等. 时间分辨荧光免疫层析法联合检测血清
肿瘤标志物 [J]. 中华核医学与分子影像杂志; 2018; 38(4): 226-270. [5]RAZO S C, PANFEROV V G, SAFENKOVA I V,, et al. Doubleenhanced
lateral flow immunoassay for potato virus X based on a combination of magnetic and gold nanoparticles[J]. Analytica Chimica Acta;2018; 1007: 50-60.
DOI:10.1016/j.aca.2017.12.023.
[6]ZHANG X, YU X, WEN K, et al. Multiplex lateral flow immunoassays based
on amorphous carbon nanoparticles for detecting three Fusantium mycotoxins in maize[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry; 2017, 65(36): 8063-8071. DOI:10.1021/acs.jafc.7b02827. 14.
[7]HU L M, LUO K, XIA J, et al. Advantages of time-resolved fluorescent
nanobeads compared with fluorescent submicrospheres, quantum dots, and colloidal gold as label in lateral flow assays for detection of ractopamine[J].
Biosensors & Bioelectronics; 2017; 91: 95-103. DOI:10.1016/ j.bios.2016.12.030.
[8]WU W D, LI M, CHEN M, et al. Development of a colloidal gold
immunochromatographic strip for rapid detection of Streptococcus agalactiae in tilapia[J]. Biosensors & Bioelectronics; 2016; 91: 66-69. DOI:10.1016/ j.bios.2016.11.038
（上接第48页）
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