摘要：转基因动物已成为生物学界科学家们研究的热点，转基因成果也在社会的各个领域有着不同程度的应用，然而传统的转基因技术有着步骤繁琐、技术要求高、转导率低和成本高等特点；本实验采用精子介导法制备转基因动物，具有高效、简便、成本低、易于筛选等特点。本实验首先采用分子克隆法制备含有绿荧光基因的转基因高效载体，然后用睾丸注射法将转基因载体导入成年雄性兔睾丸，最后让公兔和母兔进行交配，待母兔分娩后检测兔仔中是否含有绿荧光蛋白。实验结果：由于季节和饲养条件等方面的原因，母兔还未受孕分娩所以还未进行检测。 关键词：转基因动物精子介导法分子克隆睾丸注射Research of Sperm Mediated Method for Genetically
Modified Rabbit
Abstract：Genetically modified animal has become a focus of research scientists in biology community ,genetically modified achievements have different degrees of application in the various sectors of society. However, the traditional transgenic technology has steps trival, high technical requirements, low transduction rate, high cost ,ect; This experiment used sperm mediated method to cultivate genetically modified animal, which is simple and effective, low cost, easy to screening ,etc. First, this experiment used molecular cloning method to create genetically modified efficient carrier with green flu
orescent genes, then took the testicular injection method to inject transgenic carrier to adult male rabbit testicular, finally let the male and female rabbit mating, wait for the mother rabbit’s delivery, check the rabbit sons to see whether they contain green fluorescent proteins. Result of the experiment: because of the season,
raise conditions and other reasons, the mother rabbit is not pregnant so there is no childbirth for testing.
Keywords:transgenic animals sperm mediated method molecular cloning testicular injection
1 引言涂布刮刀
随着科技的发展，转基因动物已成为生物学界研究的热点，它的研究成果也被应用于我们生产生活的各个领域。转基因药物为医学界治愈某些疾病做出了重大贡献，精子介导法制备的转基因动物可以作为生物反应器生产基因药物[2]，使我们不会因看病贵的问题而放弃；我们还可以用这种方法复制人类疾病动物模型，对于人类认识疾病、研究疾病、并最终攻克疾病具有极为重要的意义[3]；精子介导法制备转基因动物还可以用来改善奶制品的质量，牛奶人乳化，这对于为人类特别是婴幼儿提供全面的营养具有积极的现实意义。本研究家兔为实验动物模型，研究精子介导法制备转基因动物的制备过程及工艺参数优化，希望可以为转基因动物育种提供有力的科学依据和实验手段。
2 实验材料
2.1 实验动物实验动物白兔购于秦皇岛养兔厂，雄性7～8月龄，雌性5～6月龄，置于自然循环的光照周期中饲养。
2.2 试剂绿荧光蛋白外源基因
2.3 实验器材冰箱，剪刀，镊子，实验钳，手术缝合针若干，手术线三根，中间有洞的白布，牛皮纸，消毒的棉球等。
折叠炕桌3 实验方法
3.1 分子克隆法制备高效转基因载体
3.1.1 载体DNA的选择质粒是细菌染体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易
制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是
“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一
至多个选择标记的特点。
3.1.2 DNA片段与载体连接粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱
基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同
的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然
飞星晒图机识别不同顺序，却能产生相同末端。分别用相同的限制性内切酶切割
质粒和外源DNA片段，在一定的条件下构建出含有绿荧光蛋白基因
的高效载体。
3.1.3 引入宿主细胞将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处
理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，
再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子。
3.1.4 重组体的鉴别有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将
重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬
菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，
形成的菌落或噬菌斑的颜有明显变化，如蓝变为无；有些λ噬
比例电磁铁
菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，
因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子，图1即为转基因载体模式图谱。
图1：转基因载体模式图谱
3.1.5 重组体的扩增首先，通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA
解离成单链DNA；当温度突然降低时，使含量远远多于模板DNA的引物与模板DNA在局部形成杂交双链；在4种dNTPs底物和Mg2+存在的条件下，DNA 聚合酶由5'-3'方向合成新的与模板DNA互补的DNA链。以上反应为一个循环，通常进行25-30个循环，由此介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制数量可达2×107拷贝。[7]对扩增之后的重组体进行电泳，观察扩增的效果。
3.2 睾丸注射法转入转基因真核表达载体
3.2.1 实验器材的消毒
3.2.1.1 预处理分类将器械用串子串好，关节齿槽全部打开，放 入清洗篮中。
预浸泡多酶或与泡剂。确认清洁剂与器械充分接触。
保湿剂泡沫型或气泡型。将保湿剂喷到器械表面，将其覆盖为止。
3.2.1.2 初洗使用多酶清洗液将器械进行初步浸泡清洗。
A 将清洗篮完全浸泡在多酶清洗液中。
B 使用软布，泡棉大面积的擦洗器械除去大块污染物。
C 刷洗后将清洗篮提起，使用流动水将器械冲洗干净。
3.2.1.3 精洗
A 将装有器械的网篮浸泡在多酶清洗液中。
B 用刷子刷洗关节部位，尽量将关节内部刷洗干净。
注：齿槽部位沿着齿纹方向纵向刷洗，钳子应使用超声加多酶。
清洗篮C 将器械全部打开，尽量贴近水面放置。
D 提起清洗篮用流动水冲洗干净，关节齿槽要重点清洗。
3.2.1.4 无机物清洗常规处理（防止因水质问题造成水垢污染）
A 使用专用长方形容器配置水垢去除剂。
B 将装有器械的网篮放在清洗剂中5min。
C 无需刷洗。
D 取出网篮。
3.2.1.5 漂洗依国家标准漂洗应使用纯化水，直接使用莲蓬头流动方式冲洗。
自动扶梯装饰3.2.1.6 润滑将装器械的网篮放在润滑剂中浸泡30秒。润滑后直接盖干，备用
3.2.2 睾丸注射法转入转基因真核表达载体
A 取出一只性成熟的实验公兔，称其体重，计算打麻醉剂的计量。（每一公斤注射0.1ml麻醉剂）对试验公兔进行注射，使其昏迷。
B待其昏迷后，将实验兔固定在实验台上，四肢用绳子捆好，用力不可太大，防止血液流通不畅。同时将实验公兔的头部固定，防止实验中兔子苏醒对实验人员产生伤害。
C 将中间有一个洞的的白布，铺在兔子的睾丸处，将睾丸露出，以便实验的进行。
D 用消完毒的剪刀将兔子睾丸周围的兔毛剪掉，注意要小心。
E 用棉球擦拭公兔的睾丸处，图3即为睾丸的解剖图谱用手术刀将兔子的睾丸皮下组织划开，必要时用
镊子到输精管，将输精管暴露出来，用注射器将新鲜制备转基因试剂注射到兔子的输精管每侧2.5ml，获得转染精子。
图3 睾丸解剖图谱
F 将消过毒的线和灭过菌的实验针穿在一起，对伤口进行缝合。
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