陈能42，姚楠3
(1.广州中医药大学第二临床医学院骨科，广东广州510120;
2.广州中医药大学第二附属医院/广东省中医院珠海医院骨科，广东珠海519000;
3.广东省中医药工程技术研究院/广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州510095)
［中图分类号］R274.398.67［文献标识码］B［文章编号］1004-2814(2021)03-0348-03
［摘要］目的：观察补肾强筋胶囊含药血清对骨关节炎滑膜细胞、软骨细胞PGE2、NGF、COX-2、MMP13基因表达的影响。方法：选取拟行全膝关节置换手术的膝关节骨性关节炎，术中取病变滑膜、软骨进行原代细胞培养，用IL-1P刺激复制骨关节炎细胞模型，用补肾强筋胶囊含药血清干预后，RT-qPCR检测PGE2、NGF、COX-2、MMP13基因表达。结果：滑膜细胞RT-qPCR检测，与OA组比较，正常组、©药血清组PGE2、压缩胶囊
tvlineNGF、COX-2、MMP-13基因表达均有统计学差异(PV0.05)；与正常组比较，含药血清组PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表达的差异均有统计学意义(PV0.05)。软骨细胞RT-qPCR检测，与OA组比较，含药血清组PGE2、COX-2、MMP-13基因表达比较差异均有统计学意义(尸V0.05)；与正常组比较，含药血清组PGE2、COX-2、MMP-13基因表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)o3组间NGF基因表达比较差异无统计学意义(P>0.05)o结论：补肾强筋胶囊含药血清骨关节炎能下调滑膜细胞PGE2、NGF、COX-2、MMP13基因表达，下调软骨细胞PGE2、COX-2、MMP13基因表达，但对软骨细胞NGF基因表达无明显调节作用。
［关键词］膝关节骨性关节炎；补肾强筋胶囊；细胞；PGE2;NGF;COX-2;MMP13
［Abstract］Objective:To observe the effect of Bushen Qiangjin Capsule medicated serum on the gene expression of PGE2,NGF,COX-2and MMP13in osteoarthritis synovial cells and chondrocytes.Methods:We selected knee osteoarthritis intended to undergo total knee replacement surgery,took the diseased synovium and cartilage during the operation for primary cell culture,and stimulated the replication of osteoarthritis cell model with IL-1P.After the intervention of medicated serum with Bushen Qiangjin Capsule,RT-qPCR was used to detect the expression of PGE2,NGF,GOX-2, and MMP13genes.Results:Compared with the OA group,PGE2,NGF,COX-2,MMP-13gene expression of the normal group and the medicated serum group were statistically diff
erent by RT-qPCR detection of synovial cells(PvO.05). Compared with the normal group,the differences in gene expression of PGE2,NGF,COX-2,and MMP-13in the medicated serum group were statistically significant by RT-qPCR detection of synovial cells(P<0.05).Compared w让h the OA group,the difference in gene expression of PGE2,COX-2,MMP-13in the medicated serum group was statistically significant by RT-qPCR detection of chondrocyte(Pv0.05).Compared w让h the normal group,the differences in gene expression of PGE2,COX-2and MMP-13in the medicated serum group were statistically significant by RT-qPCR detection of chondrocyte(P<0.05).There was no statistically significant difference in NGF gene expression among the3groups(P>0.05).Conclusion:Bushen Qiangjin Capsule medicated serum can down-regulate the expression of PGE2,NGF,COX-2,MMP13genes in synovial cells and chondrocytes respectively in treating osteoarthritis,but辻can，t regulate the expression of NGF genes in chondrocytes significantly.
［Keywords］Knee osteoarthritis;Bushen Qiangjin Capsule;Cells;PGE2;NGF;COX-2;MMP13
膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是一种发生在膝关节的退行性疾病，病理表现为滑膜炎性增生，软骨退变等，临床表现为膝关节疼痛、活动受限等。既往已有多项动物及细胞实验证实K0A的发生发展受多种细胞因子影响，其中基质金属蛋白酶(Matrix Metallo Proteinase,MMP)在KOA关节软骨的破坏中起主要作用；前列腺素E2 (Prostaglandin E2,PGE2)是炎性致痛因子；环氧合酶-2(Cyclooxyg
enase,GOX-2)是催化PG的合成的诱导酶，并参与了K0A炎症反应；神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)与神经病理性疼痛及炎性疼痛均有关⑴2〕。本研究观察补肾强筋胶囊含药学清对K0A滑膜细胞、软骨细胞MMP13、PGE2、COX-2、NGF基因表达的影响，探讨K0A的作用机制⑶。
1研究对象及分组
水管堵头选取在广东省第二中医院骨科住院的拟行全膝关节置换手术的K0A患者。西医诊断参照中华医学会风湿病学^20瞬制定的膝关节骨性关节炎诊断标准⑷o
2手术取材
术中取出病变滑膜组织，在完成股骨远端截骨后取出股骨課软骨，软骨厚度不小于1mm，尽快转移至实验室。
［基金项目］珠海市卫生健康局医学科研立项(2019-56-18)
3实验材料
主要实验仪器：SmartSpec plus核酸蛋白测定仪（Bio-Rad公司）；Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司），IQ1™'型RT-qPCR仪（Bio-Rad公司）。
药物和试剂：补肾强筋胶囊（广东省第二中医院制剂室）；重组人IL-1B试剂（Peprotech公司）；First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司）; MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix （2X）（Thermo Fisher Scientific公司）；PCR特异性引物（上海英潍捷基贸易有限公司）。
4实验方法
原代滑膜细胞培养。滑膜组织剪切碎放入培养皿中，DPBS溶液清洗弃上清液后加0.25%胰酶ImL，静置于37P,5%C（）2培养箱60min，取出弃胰酶，加入10%FBS的DMEM2mL，然后静置于37七，5%CO2ig养箱中培养。待细胞生长达瓶底90%以上后，用0.25%胰酶进行消化传代，然后继续用10%FBS的DMEM培养。
原代软骨细胞培养。软骨组织剪切成碎块放入培养皿，DPBS溶液清洗弃上清液后加入0.25%胰酶ImL，静置于37T,5%CO2培养箱30min，然后弃上清液，加入0.02%11型胶原酶，静置于37七，5%CO2培养箱内过夜后，用100am滤网过滤，加入10%FBS 的DMEM,1600rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用10%FBS的DMEM培养，待细胞生长达瓶底90%以上后，用0.25%胰酶消化传代，然后继续用10%FBS的DMEM培养［5_7］0
含药血清制备［5~7］。SPF级别SD雌性大鼠10只，体质量为180~220go把大鼠分成空白组、含药血
清组，每组5只。根据动物与人之间药物剂量换算，补肾强筋组每lkg予以0.243g生药补肾强筋胶囊溶液灌胃，空白组予生理盐水灌胃。所有大鼠连续7天每天灌胃1次，然后行腹主动脉取血，然后按3000rpm离心5min，弃上清液，56七水浴30min灭活，经0.45|jLm滤膜抽滤，分装，置于-80七冰箱保存，即为空白血清和含药血清。
细胞造模及分组⑷。将第3代细胞按每孔1x105个细胞密度种植于6孔板（n=6），培养至融合度约达80%时，弃培养基，用DPBS清洗后，进行分组处理。正常组为DMEM培养基+10%空白血清；0A组为DMEM培养基+10%空白血清，加入50ng/mL IL-1B；含药血清组为DMEM培养基+10%含药血清，加入50ng/mLIL-lp o连续培养24h后收集细胞。
RT-qPCR检测细胞PGE2、COX-2、NGF、MMP-13的基因表达。首先采用Trigol、异丙醇和氯仿等试剂提取滑膜细胞、软骨细胞总RNA。用First Strand cDNA Synthesis Kit提供的实验方法进行反转录操作，加入上述提取的总RNA，合成First-Strand cDNA o基因引物设计利用Primer6.0生物软件。然后在定量PCR 仪进行扩增和熔解曲线分析，反应结束后记录Ct值，运用2-aao法分析各组基因相对表达量。
用SPSS22.0软件进行统计分析。计量资料以（无±$）表示，多组间均值比较符合正态分布的资料采用单因素方差分析，非正态分布的资料采用非参数检验进行比较。FV0.05为差异有统计学意义。5结果
滑膜细胞基因表达比较。与0A组比较，正常组、含药血清组PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表达比较差异均有统计学意义（PvO.05）0与正常组比较，含药血清组PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表达差异均有统计学意义（PV0.05）。
表1各组滑膜细胞因子基因表达比较（n=6，応s）
组别PGE2NGF COX-2MMP-13正常组 1.00±0.40* 1.00±0.42* 1.00±0.40* 1.00土0.44* 0A组536±1.81 4.59±0.99 4.32±0.81 6.43±1.79含药血清组2.42±0.39仏2.53土0.40*°2.36±0.56，a2.87土0.73仏注：与0A组比较，><0.05；与正常组比较，Apv0.05。
软骨细胞基因表达比较。与0A组比较，正常组、含药血清组PGE2、COX-2、、MMP-13基因表达比较差异均有统计学意义（PV0.05），与正常组比较，含药血清组PGE2、COX-2、、MMP-13基因表达比较差异均有统计学意义（PV0.05）。3组软骨细胞NGF表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表2各组软骨细胞因子基因表达比较（n=6,i±s）
组别PGE2NGF COX-2MMP-13正常组 1.00±0.33* 1.00±0.13 1.00±0.29* 1.00±0.34* 0A组 3.21土1.10 1.03±0.307.48土2.15 3.61土0.91含药血清组1.56±0.33仏1.21土0.44 3.32土0.79仏2.06土0.53仏注：与0A组比较，><0.05；与正常组比较，Apv0.05。6讨论
液压软管接头
正常状态下，膝关节滑膜可产生滑液，滑液主要发挥润滑关节腔及吞噬物质的作用，软骨由软骨细胞、纤维和细胞外基质构成，细胞外基质能保护软骨细胞使其不与关节腔直接接触。KOA发生时，关节滑膜发生炎症反应，释放出炎性介质、细胞因子等物质⑷，使膝关节腔内环境处于炎性状态，导致软骨细胞外基质持续性地发生降解，当达到_定程度时软骨细胞暴露于炎性环境中，使软骨细胞逐渐失去活性，甚至死亡，最终软骨破损。此外，KOA关节腔内物质中不乏多种致痛因子，这些因子刺激神经感受器，引起了疼痛32。研究表明，KOA膝关节滑膜、软骨中一些细胞因子水平的升高影响了病情，王培等山］研究表明C0X-2mRNA在膝关节骨性关节炎病变初期滑膜细胞中表达水平较高。StoppielloLA 等「⑵发现KOA患者膝关节滑膜中NGF的表达升高，且与疼痛相关，而PecchiE等问研究采用炎性因子刺激软骨细胞时，也会使NGF表达升高。本研究使用重组人IL_1B刺激复制滑膜细胞和软骨细胞0A模型，结果表明上述因子基因表达确实有不同程度的升高，这与以往研究结果相符。
K0A属中医“痹证”范畴。潘建科等通过数据挖掘分析表明具有补肾、活血功效的中药是KOA内服处方的主要成分。补肾强筋胶囊由补益肝肾、活血通络中药组成，既能补肝肾之不足以滋养筋骨，也能通局部之淤阻以顺畅气血，从而发挥缓解膝关节疼痛，改善关节活动功能的功效。研究表明，补肾强筋胶囊能有效改善膝关节滑液中IL-1p, TNF-a、PGE2水平以及血清PGE2水平［”〕，话卜肾
强筋胶囊含药血清可显著降低软骨细胞上清液NO和PGE2水平，并显著降低软骨细胞COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13mRNA表达⑸。研究对该药
•观察与研究・
骨质疏松性椎体压缩性骨折术后应用芜活四物汤临床观察
王田资
（河南省焦作市第五人民医院康复医学科，河南焦作454000）[中图分类号]R274.183.1[文献标识码]B[文章编号]1004-2814(2021)03-0350-03
［摘要］目的：观察骨质疏松性椎体压缩性骨折术后应用芜活四物汤的效果。方法：97例采用双盲法将其分为对照组48例和观察组49例。两组术后均给予西药，观察组加用芜活四物汤。结果：总有效率观察组高于对照组（PV0.05）。后两组证候积分降低，ODI评分、COQOL评分升高，且观察组改善更明显（PV0.05）。后两组AVBH水平升高，Cobb角降低，且观察组改善更明显（PvO.05）。后两组BGP、OPG、骨密度升高，ALP、CTX-I降低且观察组改善程度优于对照组（P<0.05）。结论：骨质疏松性椎体压缩性骨折术后在西药基础上联合芜活四物汤可提高骨密度，改善骨代谢、临床症状以及腰部功能恢复，提高生活质量。
［关键词］椎体压缩性骨折；术后；芜活四物汤
椎体压缩性骨折多为外伤所致，且老年人多伴有前手术是骨质疏松性椎体压缩性骨折的主要方骨
质疏松，其骨骼脆性较高，成为多发体⑴。目式，老年人生理机能差，免疫力低下，代谢缓慢，
KOA的作用机制进行了补充，结果表明补肾强筋胶囊含药血清对滑膜细胞PGE2、COX-2、MMP-13,NGF 基因表达，对软骨细胞PGE2、COX-2、MMP-13基因表达均有一定程度调节作用，但对于软骨细胞NGF基因表达无明显调节作用。
因此，补肾强筋胶囊KOA的作用可能与调节滑膜细胞PGE2、COX-2、MMP-13、NGF以及软骨细胞PGE2、COX-2、MMP-13的基因表达有关。对于滑膜细胞，研究使用重组人IL-1B刺激，可使NGF基因表达显著升高，而采用含药血清干预能使NGF基因表达显著下调，但对于软骨细胞，无论用采取何种干预方式对NGF基因表达均无明显调节作用。研究表明，膝关节滑膜中神经分布更为密集，但关节软骨无神经支配，由于NGF分布可能与神经分布有关，因此软骨细胞NGF基因表达未发生显著变化［闵o
［参考文献］
［1］夏智，王国林.神经生长因子在炎性疼痛中的作用［J］.天津医药，2006,34（10）:719-721.［2］颜冰，戴文玲，刘吉华.神经病理性疼痛中神经生长因子的作用及其相关镇痛药物研发进展
［j］.药学进展,2019,43（2）:111-117.［3］陈能，补肾活血方对膝骨关节炎疼痛及致痛因子表达的影
响［D］.广州中医药大学，2017.［4］中华医学会风湿病学分会.骨关节炎诊断及诊疗指南［J］.中华风湿病学杂志，2010,14
（6）:416-419.
［5］姚楠，陈能，许学猛，等.补肾强筋胶囊含药血清对IL-10刺激的人原代软骨细胞的影响［J］.
临床医学工程，2017,24（3）:327-329.［6］陈国材，姚楠，刘文刚，等.补肾活血方含药血清对退变型人原代软骨细胞microRNA^达谱的影响
［J］.辽宁中医杂志，2019,46（5）:1086-1089.［7］姚楠，陈能，刘文刚，等.补肾活血方调节miRNA-14O-5p表达干预人原代软骨细胞退变的研究［J］.
风湿病与关节炎，2017,6(9):10-14.
[8]丁呈彪，周云.膝骨性关节炎患者滑膜炎的发
病机制及研究进展[J].中国组织工程研究，
2015,19(51):8327-8332.
[9]HINZ B,BRUNE K.Pain and osteoarthritis:
new drugs and mechanisms[j].Current Opinion in Rheumatology,2004,16(5):628—633. [10]YU D,XU J,LIU F,et al.Subchondral bone
changes and the impacts on joint pain and articular
cartilage degeneration in osteoarthritis[j].Clin
Exp Rheumatol,2016,34(5):929—934. [11]王培，楚天舒，阎磊，等.COX-2mRNA在膝
骨关节炎病变过程中的作用研究[J].临床医
学工程，2019,26(4):477-478.
[12]STOPPIELLO LA,MAPP PI,WILSON D,氢氧发生器
et al.Structural Associations of Symptomatic Knee
Osteoarthritis[j].Arthritis&Rheumatology,
2014,66(11):3018-3027.
[13]PECCHI E,PRIAM S,GOSSET M,et
al.I nduction of nerve growth factor expression and
release by mechanical and inflammatory stimuli in
chondrocytes:possible involvement in osteoarthritis
pain[j].Arthritis Res Ther,2014,16(1):R16.
[14]潘建科，洪坤豪，刘军，等.基于关联规则
和复杂系统爛聚类的膝骨关节炎用药规律
研究[J].中国实验方剂学杂志，2015,21
(12)：201-204.
[15]李慧，曾明珠，张瑜.补肾强筋胶囊对早中期膝
骨性关节炎滑液中白细胞介素-10、肿瘤坏死因
子-a、前列腺素已_2及血清前列腺素已_2的影响
[J].中国医药导报,2019,16(15)：119-123.
[16]王大勇.膝关节骨关节炎滑膜中神经末梢分布和
不良图片过滤Neuritin水平检测与观察[D].石河子大学，2011.
[收稿日期]2020-08-19
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议