S D S-聚丙烯酰胺凝胶
电泳标准操作规程
(12%胶)
-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，14.4-97KD）
1电泳各试剂的配制
1.1凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，
碱性水机2.67%C)——为聚丙烯酰胺
撞钉取丙烯酰胺acrylamide 29.2 g、双丙烯酰胺N′N′-bis-methylene-acrylamide 0.8 g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。4℃避光储存。 1.2 即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配）
称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。
1.5M Tris-HCl，pH 8.8
称取Tris base 18.15 g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH 8.8，再加去离子水至总体积100mL。4℃储存。
0.5%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝0.5g，去离子水定容至100mL。
0.5M Tris-HCl，pH 6.8：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH 6.8，再加去离子水至总体积100mL。4℃储存。 10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。
1.3 凝胶配制
加入100 μl 10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。 电机风叶
其中：TEMED为催化剂
1.4 10×电极缓冲液，pH 8.3
称取Tris base 30.3 g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS 10.0 g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。4℃储存。临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。
1.5 样品溶解液S
去离子水 3.55mL；
0.5M Tris-HCl，pH 6.8 1.25mL；
glycerol （甘油） 2.5mL
10% (w/v) SDS 2.0mL
0.5%（w/v）溴酚蓝 0.2mL
总体积为9.5 mL。室温储存。临用前加50 μlβ-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）于950 μl样品缓冲中，即为样品溶解液。
2染各试剂的配制
2.1 固定液：50%乙醇，12%冰醋酸，0.1%甲醛（即250ml无水乙醇+60ml冰醋酸+0.5ml甲醛+去离子水至500ml）
2.2 洗涤液：50%乙醇（500ml无水乙醇+500ml去离子水）
2.3 敏化液：0.02%无水硫代硫酸钠（62.78mg五水硫代硫酸钠，加去离子水定容至200ml）
2.4 染液：0.5% 硝酸银，0.075%甲醛（临用现加）（0.5g硝酸银+100ml去离子水+197ul甲醛）甲醛临用现加
2.5 显液：6%无水碳酸钠，0.0004%硫代硫酸钠，0.05%甲醛（临用现加）（即60g无水碳酸钠+6.28mg五水硫代硫酸钠+去离子水至1000ml作为显贮备液，每次用时取100ml+132ul甲醛即得）
2.6 终止液：50%乙醇，12%冰醋酸（250ml无水乙醇+60ml冰醋酸+去离子水至500ml即为终止液）
以上均用去离子水配制。
3针晶提取
圆机罗纹
3.1取新鲜天南星科药材，去皮。
3.2切碎至约3 mm2。
羟甲基丙烯酰胺3.3将已切碎的药材置于大小适宜的洁净研钵中，加入2倍体积石油醚
（60~90°）研磨，每次约5~10 min，反复多次。
3.4将石油醚溶液倒出，经4层医用纱布过滤，合并滤液，用孔径0.22 μm的偏
氟膜抽滤，得滤饼。
3.5取滤饼适量于离心管中，加入30倍体积的四氯化碳，混匀，8000 rpm 离心
3min（三楼），去除四氯化碳液，反复3次。
3.6离心后的下层沉淀中加入石油醚（60~90°）适量，混匀，用孔径0.22 μm
的偏氟膜过滤，得滤渣，即为毒针晶蛋白纯化的样品。
4实验步骤
4.1样品制备精密称取半夏及其它样品纯化毒针晶蛋白适量，分别以移液加载荷谱
入样品溶解液，使浓度为30 μl/mg混匀（，将各样品液及未预染标准蛋白于沸水浴中加热5 min后，置于高速离心机中，10000 rpm离心3 min（五楼）。
4.2上样精密吸取各样品液10 μl、标准蛋白液5 μl，按电泳仪使用说明中的上
样方法上样。
4.3电泳
设置电流强度为：浓缩胶10 mA、分离胶16 mA。
4.4固定将胶从玻璃板中取出，切角标记。放置适宜容器内，以固定液固定，
平稳放置摇床上，室温下固定1 h以上。
4.5清洗将固定液倾倒出，加入洗涤液，反复洗涤3次，每次5 min。
4.6敏化将洗涤液倾倒出，加入敏化液，敏化1min。
4.7清洗将敏化液倾倒出，加入去离子水，反复洗涤3次，每次1 min。
4.8染将去离子水倾倒出，加入染液，避光染20 min。
4.9清洗将染液倒出，加入去离子水，反复洗涤3次，每次1 min。
4.10显将去离子水倒出，加入显液，先荡洗片刻后除去，再次加入显
液，注意观察，至显示清晰条带即可停止显。
4.11终止显当胶上呈现出清晰地蛋白条带，即将胶取出，放入终止液中，
终止显10min。
4.12保存将终止显的凝胶放入水中，保存。
4.13凝胶摄像在图像处理系统中将显好的凝胶摄像。
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