国际免疫学杂志202 丨年 1月第44 卷第 1期I n t J Immunol，Jan. 2021，Vol. 44，No. 1•15 •
.论著•
肺泡表面活性蛋白A调控Tfh亚分化缓解
徐淑琴1张晓云2薛明慧^聂小蒙3蔡刚1
1上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科200025 ;2解放军908医院检验输血科，南昌
330000;3长海医院呼吸内科，上海200000
通信作者：蔡刚，Emai丨：caigangsm niu@h otm ail，电话:021'64370045
tf2o
前两位作者对本文有同等贡献，均为第一作者
【摘要】目的探究肺泡表面活性蛋白AUurfactam protein A，SP-A)能否通过调控滤泡辅助性T
细胞（follicular helper T (‘ell,TfM的分化参与调节哮喘病理过程。方法 6 ~ 8周的雌性野生型（wikl-
type, W T)及SP-A基因敲除（Sp-a —")型C57BL/6J小鼠，利用鸡卵白蛋白（ovalbumin，OVA)和氢氧化锅 免疫构建哮喘模型（W T哮喘小鼠:8只,.SP-a _ __哮喘小鼠:8只），并分别设立磷酸盐缓冲液（phosphate
iKifftr salinf,PB S)处理的对照组（W T对照小鼠:6只,S/wi—>对照小鼠:4只）H E染观察小鼠肺部
病理改变，流式细胞术检测脾脏和纵隔淋巴结中T lh细胞及其亚的组成,T fh业根据其胞内干扰
素-7( interferon-*y,IFN--y)、白细胞介素（inter丨eukin, IL)-17 和IL4 的表达情况，分别定义为IFN-7* Tfh、
1L-17 + Tfh和丨L~4 * Tfh 细胞酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，EL1SA)用于检测支高压直流供电
气管肺泡灌洗液（hronchoalveolar lavage fluid,liALF)中免疫球蛋内（immunoglobulin，lg)E 的水平：将 T-B
细胞共培养，检测培养体系中丨g E抗体的水平在体外，给予人肺泡表面活性蛋白A ( human SP-A，
hSP-A)处理并设立对照组，培养5 d后检测体系中T ih亚的分布情况、结果OVA激发后小鼠BALI•’
中和肺组织内有大量炎症细胞沒润,W T及S P-a_“哮喘小鼠B A L f中炎症细胞总数显著高于其相对应
对照组小鼠[(11. 38 ± I. 43) x I04比（6. 40 ±0. 68) x 104，（ 14. 38 ± 1. 52) x 104比（6. 25 ± 0. 48 ) x 104，（
值分别为2. 61和3.64,P值均<0.05]，差异具有统计学意义另外,OVA激发后，W T和S P-a __哮喘
小鼠BALF中IgE的水平明显高于其相应的对照组小鼠[(16. 85 ±2. 50)pg/m L比（4. 94 ±2.01 )Pg/mL,
(25. 52 ± 3. 17) pg/mL 比（8. 05 ± 2. 90) Pg/mL，，值分别为 3. 63 和 3. 58，/)值均 < 0. ()5)]，且Sp-a —_哮喘
小鼠BALF中lgE抗体的水平明显高于W T哮喘小鼠（<=2. 20丨<0. 05)，差异具有统计学意义。进一
步研究显示，Tft €组成在哮喘模型的W T和冲-tT -小鼠中存在不同，表现为SP-a. —_哮喘小鼠
lL^TTfh细胞比例高于W T哮喘小鼠，IFN-7‘ T fh细胞比例降低，但差异并不具有统计学意义
(p>().〇5).m细胞的亚组成发生变化，其中+™比例1ii肺泡灌洗液中7K平呈正相关（r =
0.50,P<0.05)，而UTN-7 + T fh比例与肺泡灌洗液中IgE水平呈负相关（;•=-0.56，P <0.05)。脾脏中
1FN-7 + T fh/IL^r m的比值在知-哮喘小鼠中显著低于W T小鼠（i = 2. 31, P <0. 05 )，且与肺泡灌
洗液屮IgE呈负相关（/■= -0.55.P<0.05) T-B细胞丼培养实验发现,SP-U- _小鼠脾脏来源Tfh细胞
具有更强的辅助B细胞合成IgE抗体的能力（f =3. 18,P <0. 05)：后续的体外T细胞刺激实验证实，
hSP-A处理可以上调培养体系中丨F N-V T O细胞比例与IFN-y + T I h/K T f h的比值值分别为6. 34和
3.丨6丨值均<0.05)，但并未明显改变Ib4*T fh细胞比例（P>0.05)，结论异常的T f t细胞亚分布
与哮喘的发生相关，SP-A可能通过稳定T h细胞亚的分布，从而缓解哮喘H道炎症反应。
【关键词】哮喘；滤泡辅助性T细胞亚；肺泡表面活性蛋白A
1)01 ： 10. 3760/cma. j. issn. 1673-4394. 2021.01.003
电源线扣
Surfactant protein A alleviate asthma airway inflammation by modulating Tfh subsets distribution
Xu Slmqin' ,Zkang Xiaoyun2 ,Xue Mingliui' ,Nie Xiaomengi ,Cai Gang'
'Department o f Laboratory Uedkine ,Ruijin Hospital ,Chnnghai Jiaolong University School o f Medicine ,Shanghui
• 16•
200025 .C hina；2Department of Blood Transfusion ,90% Hospital of Chinese People's Liberation Army Joint L)gis-
tics Support Force .Narwhang 330000 .China；' Department o f Respiratory Medicine .Changhai Hospital .Shanghai
200000, China
Corresponding author：Cai Gang,Em ail：c(iigangsnimu@ hotmail. com/J'cl：************
Xu Shuqin and Zhang Xia〇)v,n are the first authors who contribute equally to the article.
【Abstract】Objective To explore whether suriactant protein A(SP-A) takes elfecl in the pathogenesis
of asthma by modulating follicular helper T c：ells(T fh). Methods 6〜8weeks old female wiki type ( WT) and
SP-A gene knockout(5/;-a ~~) mouse on C57BL/6J backgrounil were immunized by OVA and aluminum hy
droxide (WT asthma mouse ：8cases, Sp-a asthma mouse ：8casevS) , and PBS control groups were estab
lished ( WT control mouse：6cases ^ Sp-a~ ~control mouse ：4 cases). HE staining was used to visualize the
pathological changes in lung and flow cytometry was used lo detect the distribution of l'fh cells and subsets in
spleen and mediastinal lymph nodes. Tfli subgroups were clefined as interferon-，Y ( IFN-"y ) +Till, interleukin
(IL)-17 Tfli and IL-4 Tfh cells,according to their intracellular IFN-*y，IL-17 and IL-4 expression respeclive-
ly. The level of immunoglobulin(Ig) E in hronchoalveoiar lavage fluid ( BALF) ami T-B cocullun* system was
measured hv enzyme linked ininiunosorbent assay( ELISA). Besides,naive T c^ells were treated bv human SP-A
(hSP-A) in vitro,and the distribution of Till subsets was measured 5 d later. Results We have found lhat a
large number of inflammatorv cells infiltrated in BALK and the lung tissue of mouse after OVA challenged. The
total numl)er of inflammatory cells in By\LF of WT and Sp-a"asthma mouse was significanlly higher than that
of ihe corresponding control mouse [ (11.38 ± 1.43) x 104 vs(6. 40 ± 0. 68) x 104，(14. 38 ± 1 • 52) x 10J vs (6. 25
±0. 48) x 104,t values were 2. 61 and 3. 64,respectively,all P values <0. 05]. In additon,the level of total IgE
in BALF of \^T and Sp-a ~asthma mouse were significantly higher than those of the correspomiing control mouse
「（ 16. 85 ±2. 50) pg/mL vs(4. 94 ± 2. 01 ) pg/mL, (25. 52 ± 3. 17 ) pg/mL vs( 8. 05 ± 2. 90 ) pg/iiiL, / values
were 3. 63 and 3. 58, respectively, all P values <0. 05) ] ,and the level of IgE in Sp-a ~~asthma mouse increased
significantly than that of WT asthmatic mouse(/ =2. 2(),f* <0. 05). In further study w e' have lound that the dis
tribution of Tfti cells skewed in WT anti Sp-a asthma mouse. Fhe percentage of IL^4 + Tfli cells increased in
Sp-a mouse,and the [iroportion of IFN-^' Tfli cells decreased in Sp-a~~mouse, hut the difference was noi
stalisticallv s ig n ilic a n t(>0. 05). But the subgroup composition of Tfli cells changed. I he percentage of IL-4 +
Till cells was positively correlated wilh the level of lgE( r =0. 50,/^ <0.05) , while the proporlion oi
cells was negatively correlated with the level ofIgE( r = -0. 56，/) <0. 05 ). The ratio ol IFN-7 ’ T fh/1L4+Tfli in
the spleen in Sp-a~ ~asthma mouse was significantly lower than that in WT mouse(/ =2. 31 ,/J <0. 05) ,and was
negatively correlated with the level of lgE( r = -0. 55, F<0. 05). In the further study we have found that THi
derived from Sp-a "mouse have advantage in helping B cells synthesize IgE antibodies(/ =3. 18,<0. 05 ).
SuhsequenlK ,vitro experiments showed thal hSP-A treatment up-reguiated the percentage of 1F.N-*y Tfli cells and
the ratio of 1FN-*y + Tfli/IL-4 + Till(/ values were 6. 34 and 3. 16,respectively,all P values <0. 05) , while the per
centage of I L^+ Tfh cells showed no significant changes{ P >0.05).Conclusion r Fhe abnormal distribution of
Tfh subsets is associated with the pathogenesis of asthm a,and SP-A ameliorate asthma airway iiiflammalion by sta
bilizing the distribution of Tfh cell subgroups.
【Key words】Asthma;Follicular helper T cells subsets; Surfactant prolein A
DOI ： 10. 3760/cm a. j. issn. 16734394. 2021.01.003
国际免疫学杂志2021彳丨：丨月第44卷第1期I nt J I mmunol，Jan. 2021，V(>l.44,N〇. 1
哮喘是一种累及全球3.3亿人的常见呼吸道炎 症性疾病|:，临床表现为一系列反复发作的呼吸道 症状如胸闷、气急、呼吸困难、喘息和咳嗽2。哮喘 的诱因和发病机制极为复杂，对过敏原高亲和力的 免疫球蛋白（im m u iio glo h u lin J g)E在哮喘的发病机 制中发挥了重要作用3。肺泡表面活性蛋白A (surfactam p ro te in A，SP-A)是由II型肺泡上皮细胞 分泌的一种蛋白，不仅可以降低肺泡表面张力还参 与呼吸道黏膜的免疫调控|4+。研究显示，哮喘患 者肺泡灌洗液中SP-A的水平低于健康对照者，且SP-A基因敲除的小鼠较正常小鼠在哮喘的模型 中表现为更严重的肺部炎症细胞浸润和更高的肺泡
国际免疫学杂志202丨年丨月第44卷第1期丨n U Immun〇l,Jan.2021 ,V〇1.44,N〇.1.17•
灌洗液总IgE水平[9:。这些研究提示SP-A可能在 调节哮喘呼吸道黏膜炎症反应和丨gE抗体生成中发 挥了重要作用，但是目前具体机制不明。
滤泡辅助性 T细胞（follicular helper T cell,Tfh)特征性的表达CXC趋化因子受体5((：4-(：〇^〇1〇-k in e receptor typ e 5, CXCR5)可趋化其进入生发中 心，辅助B细胞的分化、抗体类型转换及高亲和力 抗体生成:l°_n，它是最为重要的B细胞辅助细胞；既往有报道证实SP-A对T细胞具有调节功能>，但其是否参与Tfh的分化及功能调控尚不明确。由于前期报道证实SP-A的水平与IgE的生成相关，我 们推测是否SP-A可通过调节m，参与IgE抗体生 成调控，发挥其抑制哮喘发作用的作用。在本研究 中，我们基于知小鼠构建的气道炎症模型及一系列相关体外实验证实,SP-A能够改变Tlli亚 内干扰素-(in terfero n-"/,IFN-*y)+T fh/IL~4 +Tfh 的比例，且调节B细胞分泌IgE的能力。这些实验结 果表明SP-A可以通过调节TfTi亚的分化而参与 调节IgE介导的气道变应性反应。
1材料和方法
1.1材料
哮喘模型：无特定病原体（specific p ath o gen Free,SPF)级别的6 ~8周C57BL/6背景的雌性野 生型（w ild-type,WT)及SP-A基因敲除（知-a"_)小 鼠（SCXK(沪）2〇18^0007)，饲养于实验动物中心。所有动物实验遵守相关动物实验伦理要求。卵清蛋 白（ovalbum in,OVA)(美国Sigma公司）用于致敏
和 激发小鼠哮喘模型，在第〇、7和14天分别腹腔注射 200斗含20网OVA和1.36%氢氧化铝的混合物。OVA致敏的哮喘组中W T和Sp-t"小鼠各8只。对照组以隣酸盐缓冲液（p h osp h ate buffer saline, PBS)替代OVA进行同样的处理。PBS处理的WT 小鼠6只，PBS处理的SP-a_"小鼠4只，在第21 ~ 23天，将小鼠置于特制的雾化箱中以1.5%的OVA 雾化激发30 m in。末次激发24 h后麻醉处死小鼠，1mL冷的PBS用于支气管肺泡灌洗液的冲洗，摘取 肺组织进行H E染，摘取脾脏和纵隔淋巴结进行 Tfh细胞及其亚分析。
1.2研究方法
1.2.1流式分析：摘取小鼠的脾脏和纵隔淋巴结，碾磨裂解红细胞处理后，用200目的细胞滤网过滤形成单个细胞悬液。取l xl O6细胞，用50n g/mL的佛波脂、1pg/mL的离子霉素和布雷德素A于37T 5%C02的细胞培养箱中剌激4~6 h，并进行表面和 胞内荧光抗体的标记。标记的抗体为：V500-Z〇〇n i-bie(美国BioLegend公司），FITC-conjugated-anti-m uCD4 (美国 eBioscience 公司，GKl. 5 )，Pacific Blue-conjugated-anti-niuCXCR5 (美国 BioLegend 公 司，L138D7 )，PE-conjugated-anti-m uIL~4 (美国 eBio~ science公司，11B11)，APC-conjugated-anti-mulL-17A (美国 BioLegend 公司，TC11-18H10_ 1)，APC/Cy7- conjugated-anti-m u lFN-^y (美国eBioscience公司，XMG1.2)。CantoII流式仪（美国BD公司）和D iva (美国BD公司）软件分别用于Tfh细胞其亚检测 和数据分析。
1.2.2 酶联免疫吸附试验（en zym e lin ked im m un o so rb en t assay,ELISA)：收集的小鼠支气管肺泡灌 洗液离心（1300 g)收集上清后冻存于-80 T冰箱 用于IgE(美国Invitrogen公司）抗体表达水平的检 测，具体的操作流程参考其说明书。
1.2.3 H E染：摘取小鼠肺组织固定于4%的多 聚甲醛，常规石蜡包埋、切片、烤片后进行H E染。普通光学显微镜观察肺部炎症变化及炎症细胞浸润 程度。
1.2.4 人肺泡表面活性蛋白A(h u m an SP-A, hSP-A)纯化：收集肺泡蛋白沉积症患者的肺泡灌洗 液用于纯化hSP-A，方法同文献报道:13:。鲎实验检 测内毒素量低于〇.〇1 P g/mg蛋白。
1.2.5细胞培养：摘取小鼠的脾脏和淋巴节，碾磨 裂解红细胞处理之后，采用CD4+CD62L+的分选磁 珠（德国M ilten yi Biotec公司）分选初始T细胞，用 RPMI1640完全培养基（美国Gibco公司）重悬细胞 后，以1x105/孔的密度将细胞接种至预先包被an-ti-CD3 和 anti-CD28 小鼠抗体（美国 BioLegend 公 司）的96孔板中。实验组额外添加20 |xg/mL纯化 的hSP-A，对照组添加同样体积的PBS，实验组与对 照组均设立一个复孔。37 $,5%C02条件下培养 5 d，分别检测处理组和对照组Tfh亚分布的情 况。体外T-B细胞共培养实验，将WT和知-a-z哮 喘小鼠脾脏来源的纯化的CD4+ CXCR5+细胞与 CD19 +B细胞按照2x l05: 1xlO5的比例置于96孔 U底细胞培养板中进行共培养,5d后检测培养上清 中IgE 抗体的表达。
•
18 •
国际免疫学杂志2021年1月第44卷第1期Im JImrmm 〇l ，Jan.2021，V 〇1.44，N 〇. 1
OVA 20 pg ；腹腔免疫
雾化吸入收集数据1.36%AL^ (O H ),
1.5%OVA 30 min
^
WT 对照组
知-f 对照组
图2对照组与哮喘组小鼠BALF 中IgE 抗体的改变
Ig ：免疫球蛋白，下同。与对照组相比,"P <〇.〇5；与W T 哮喘小鼠相比/P c O .OS 。
2.3 对照组与哮喘组小鼠脾脏和纵隔淋巴结中 Tfh 细胞及其亚组成的变化
OVA 末次激发的24 h 后，摘取小鼠的脾脏和纵 隔淋巴结进行分析。首先通过FSC 和SSC 选择待 分析细胞，选择Zoombie 阴性细胞为活体细胞，
光纤环网图1对照组与哮喘组小鼠肺部病理改变1A .哮喘模型 的构建流程；丨B . PBS 和OVA 处理后W T 和Sp-a _小鼠 BALF 中炎症细胞计数；1C . PBS 处理和OVA 处理后WT 和Sp -a __小鼠肺组织H E 染（100 x )。SP -A ：肺泡表 面活性蛋白A ;W T 小鼠：野生型小鼠；OVA ：卵清蛋白;
小鼠:s p -a 基因敲除型小鼠;a l (o h )3：氢氧化
招，下同；与对照组相比<0.05 =
©
141
i
21-23 24
11 1
1.3
统计学方法
G raph P rism versio n 6用于数据分析，计量资料 均用M ean ±SD 表示。两组数据之间的比较采用Z 检验，多组间比较采用O ne-w ay ANOVA 分析，连续 数据的相关性分析采用Pearson 相关，以P <〇. 〇5为差异有统计学意义。
2
结果
2.1对照组与哮喘组小鼠肺部病理改变
小鼠哮喘造模流程如图1所示，基
于
小
鼠及其同系W T 小鼠构建OVA 哮喘模型并设立
P B S 对照组，末次激发24 h 后检测小鼠肺部组织病
理学变化。对照组的W T 和知-a 小鼠其肺部组织学形态一致。经OVA 致敏及激发后，实验组小鼠 肺部出现明显的炎症样改变，主要表现为支气管周 围明显的炎症细胞浸润，支气管粘膜上皮增厚和支 气管周围水肿，其中知-a -a 小鼠较WT 小鼠表现为 更严重的肺部炎症细胞浸润程度和面积。进一步通 过对不同实验组小鼠BALF 中细胞学分析，OVA 处 理后知小鼠BALF 中炎症细胞总数显著高于 相同背景对照组的小鼠[(14.38 ± 1.52 ) x 104比
(6.25 ± 0.48) x 104;t =3. 64，P <0• 05]，WT 哮喘
小鼠也明显高于同背景P B S 对照组小鼠[(丨1.38 ±1.43 ) x 104 比（6. 40 ± 0• 68 ) x 104，（ = 2. 61 , P <0• 05 ]，且S/)-a
哮喘小鼠BALF 中总白细胞计
数较WT 哮喘组小鼠升高更为明显，但差异都未达 到统计学意义>〇.〇5)。
2.2 对照组与哮喘组小鼠BALF 中IgE 抗体的改变
与PBS 处理的对照组小鼠相比，OVA 处理的 WT 哮喘小鼠BA LF 中IgE 抗体的水平明显升高 [(16. 85 ±2. 50) pg/mL 比（4. 94 ± 2. 01) pg /mL ; t = 3. 63,P <0.05]，知-a -/_ 哮喘小鼠 BALF 中 IgE 抗 体的水平也显著高于同背景P B S 对照组小鼠 [(25. 52 ±3. 17) pg/mL 比（8. 05 ± 2. 90) p g /mL;t = 3. 58，P < 0.05)，且哮喘小鼠 BALF 中 IgE 抗体的水平明显高于W T 哮喘小鼠（< =2. 20, P <〇. 05)。这一结果提示了 SP -A 可能通过对IgE 的 调节，参与介导抑制哮喘炎性反应（图2)。
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5 5
4 3
2
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)恒功率直流电源
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国际免疫学杂志2021年1月第44卷第】期丨nt J ImmunoUan.2021 ,V 〇1.44，N 〇. 1
• 19 •
IWT-村照组 ■ WT-哮喘组 Sp-a'A -Asth i Sp-aT •对照组
_ WT-对照组 ■■ WT-哮喘组
™ Sp-a'/*-Asth
1 Sp-aV -汾 M 组
图3四组小鼠脾脏和纵隔淋巴结中Tfti 细胞及其亚组成的变化3A. Tfli 细胞及其亚的流式设门流程;3B. CD4 +
CXCR5 +细胞的比例;3C. IFN-7+Tfti 细胞的比例；3D. IL 4+T fh 细胞的比例;3E. lL-17 + T fli 细胞的比例;3F. IFN-7+Tfh/ IL4 + m
比值。IL ：白细胞介素;lFN-7：干扰素-7;Tfh：滤泡辅助性T 细胞，下同。与相应的对照组相比，1T <0.05；与WT 哮
喘小鼠相比，bP < 〇.〇5,:
通过CD 4和CXCR 5确定Tfh 细胞，通过其胞内细 胞因子IFN -7、IL -17和II .4的表达，分别定义其为 IFN -7 + m 、IL -17 + Tfh 和 IL 4 + Tfh 。结果显示，脾脏 和纵隔淋巴结中T &细胞的比例在两组对照组及两 组OVA 处理组之间都没有显著差异（P >0.05)，但 是Tfli 细胞的亚组成发生变化。在OVA 处理的 WT 和S /w T 〃小鼠中，脾脏来源的IFN -7+ m 细胞 比例均显著低于相应对照组小鼠0值分别为2. 49 和3. 51，P 值均<0. 05)，但Sp -a _〃哮喘小鼠与WT 哮喘小鼠之间无统计学差异（P >〇.〇5)。在OVA 处理的WT 和办-cT 〃哮喘小鼠中，纵隔淋巴结来源 的IFN -7 + T f }i 细胞比例亦低于PBS 对照组小鼠，且
哮喘模型小鼠最低。与之相反，我们发现
WT 哮喘小鼠及S /w T "哮喘小鼠纵隔淋巴结及脾 中IL ^T T fh 细胞比例较相应对照组小鼠都显著升 高(《值分别为2. 20,2. 71,2. 25和3.45，P 值均< 〇. 〇5)，虽然办-a 哮喘小鼠高于WT 哮喘小鼠，但差异并不具有统计学意义（P > 〇.〇5)。进一步分析 发现，纵隔淋巴结及脾脏中IF N i + T f ^n ^T T fli 比 值在W T 哮喘小鼠和哮喘小鼠中显著低于 同背景PBS 对照小鼠（< 值分别为2. 53,4. 59,7. 38 和5.55，P 值均<0.05)，且该比值在哮喘 小鼠的脾脏中也显著低于WT 哮喘小鼠(<=2.31,P <0.05)(图 3)。
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