张荣华;王曦;李武峰
【摘 要】自首例克隆羊“多莉”诞生以来,哺乳动物克隆技术研究就广受关注,应用此技术已获得了小鼠、水牛以及家兔等动物.总结了近年来克隆过程中的关键技术和获得的研究成果,不仅更进一步了解了胚胎发育、细胞生长等生物现象,同时也为将来解决克隆中存在的问题,如成功率低、胎盘肥大、重编程异常、出生死亡率高等奠定了理论基础,开拓了新的思路.随着哺乳动物克隆技术的迅速发展,其在多个领域应用前景广阔,如利用克隆技术进行快速大规模的品种改良、有效地保护濒危动植物,并可将核移植技术应用于疾病的,通过克隆生物反应器生产所需的物质,具有重要的实践意义.%Since the birth of the first cloned sheep "Dolly",mammalian cloning technology has attracted much attention.Using this technology,mouse,buffalo,rabbits and other animals had been obtained.In this paper,the key techniques and achievements of cloning in recent years were summarized,which was not only to further understand the embryonic development,cell growth and other biological phenomena,for the future to solve the problems in cloning,such as low success rate,place ntal hypertrophy,reprogramming abnormalities,high mortality and lay the theoretical basis,opened up new ideas.And with the rapid development of mammalian cloning technology,it had a good prospect in many fields.Such as the use of cloning technology for rapid and large-scale varieties of improved,optimized and effective protection of endangered plants and animals,and nuclear transplantation technology for the treatment of diseases,cloning bioreactor production of the required material,has a very significant practical significance.
【期刊名称】《山西农业科学》
声纳探鱼器【年(卷),期】2017(045)009
【总页数】6页(P1577-1582)
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【关键词】哺乳动物;克隆技术;胚胎重组
【作 者】张荣华;王曦;李武峰
【作者单位】山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;山西省农业科学院畜牧兽医研究所,山西太原030032;山西省农业科学院畜牧兽医研究所,山西太原030032;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801
【正文语种】中 文
【中图分类】S811.4
希腊语“klon”就是克隆，指用小枝丫去增殖，开始于植物学[1]。动物克隆广义上讲是指动物的无性繁殖，18世纪兴起了微生物学，科学家们观察到低等动物一般通过分裂、出芽和断裂3种方式进行繁殖，这些都是“克隆”——无性繁殖[2]。目前人们研究的克隆是人为干预的无性繁殖。此技术发展至今，可用胚胎细胞或体细胞进行克隆而获得个体。具体的克隆大致可分为细胞核移植[3]和胚胎分割[4]2种。通常人们所谓的哺乳动物克隆是指前一种，并且也获得了很多克隆动物。
克隆试验的成功无论是在理论还是应用方面都具有重大意义。理论上，它打破了传统思维，即动物细胞的生长、分化是不可逆的。证实了已分化的体细胞核与受精卵相似，在适
当的条件下，可以恢复其全能性，发育成为新的个体。同时，此理论为遗传学、基因表达调控等方面提供了新的思路。应用上，克隆技术可以加快优良家畜品种的繁殖。自然繁殖时，优良家畜都是经过多次杂交、基因重组产生的。此过程耗时长，成本高，工作量大，而且因基因突变导致优良性状消失的概率大。而利用体细胞克隆技术则可解决以上问题。此外，克隆技术可以用于保护濒危动物，通过构建基因库，利用克隆扩大动物的体。在医学研究方面，利用克隆技术培育器官，避免了排异性，提高了安全性且可以保证大量供应。
本文介绍了目前克隆技术各过程的主要方法与存在的问题，并指出进一步的研究方向。
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胚胎克隆即采用专门的方法和技术建立胚胎的无性繁殖系，以获得具遗传同质性动物（克隆动物）的过程。胚胎克隆从广义来讲，可分为胚胎分割以及细胞核移植，狭义的即胚胎细胞核移植技术。该技术是将早期胚胎细胞的细胞核或卵裂球，通过融合、激活和体外培养等方法，移植到去核卵母细胞中，构成新合子，然后移植给受体。此生物技术所获得的后代将与核供体基因型相同[5]。提出胚胎克隆的理论基础是胚胎细胞与受精卵一样，都具有发育全能性。但因为早期试验条件有限，且哺乳动物的受精过程在体内发生，所以，首 次胚胎细胞核移植成功是在1952年BRIGGS等[6]研究的两栖类动物——美洲豹蛙。随后体外受精兔也获得成功，为哺乳动物胚胎细胞核移植技术奠定了基础。
胚胎干细胞是一种可分化成多种功能型细胞的细胞类型[7]。目前，从组织中已分离出了胚胎干细胞（ES）和成体干细胞。其中，胚胎干细胞是从早期胚胎中分离出的高度未分化、具有发育全能性和多能性的一类细胞[8]。ES细胞的多能性是指它具有发育成为不止一种细胞或组织的能力。ES细胞的全能性概念是它可以在某条件下去分化，再生为机体内的各组织甚至可发育成完整个体的能力[9]。
仙台病毒根据以上的理论基础，动物克隆的方法之一就是胚胎干细胞核移植技术[10]。研究者们用ICM细胞为供体构成克隆胚，发育成正常仔鼠。CAMPBELL等[11]将ES细胞传至3代后进行核移植，也获得4只绵羊。另外，此方法在兔、山羊和牛等动物上都取得了进展，但此技术仍不成熟，尚待进一步研究[12]。
体细胞核移植技术（SCNT）是将一个动物的体细胞核移植入去核的卵母细胞中，重构克隆胚，发育为与供体动物细胞基因完全相同的后代[13]。
早期人们认为，细胞的分化程度越高，其全能性越差，甚至已高度分化的体细胞则完全丧失全能性。因此，人们的研究集中在胚胎干细胞上。直到BRINSTER[14]研究发现，体细胞可脱分化抑制重新发育分化，打破了以往的观念。而体细胞的核移植研究技术是在1997年WILMUT等[15]宣布世界首例体细胞克隆绵羊“多莉”诞生，才变成焦点。应用此技术已成功获得了大鼠、兔、骡子、马、水牛、欧洲盘羊[16]和非洲野猫等动物。同时，此技术还可保护珍稀的濒临灭绝的动物，例如雪貂[17]。
SCNT技术的应用领域十分广泛，如加速繁殖优良畜种，培育转基因品种[18]，利用克隆技术疾病[19]，保护濒危物种等。但总的来说效率很低。KISHIGAMI等[20]研究指出，利用SCNT技术克隆出的动物常有异常，如胎盘肥大、胎儿患呼吸疾病等问题，且克隆动物成活率仅为2%。现在许多学者正努力探究着影响体细胞克隆成功率的因素，如核供体、核受体、供受体间的相互作用及核移植操作技术等。
克隆技术的第一步就是选择受体细胞。早期人们使用去核受精卵，但因为受精卵已被激活，重编程能力差，所以，越来越多的试验使用MⅡ期成熟卵母细胞为受体。这是因为MⅡ期的卵母细胞周期长，并且去分化的必备因子——MPF活性高，对供体细胞核的重新编程更有利[21]。
WILLADSEN[22]第1次用去核的成熟卵母细胞作受体，获得了克隆绵羊。之后CHESNÉ等[23]先将卵母细胞注射HCG，再培养16 h用作受体，囊胚率为47%，并得到了胚胎克隆兔。陈大元等[24]将卵母细胞培养大约19 h，选择第一极体刚形成的做胞质受体，囊胚率约26.63%，并获得克隆牛。
同样，MⅡ期卵母细胞做核受体前，进行激活或未激活的结果也大不相同。研究证明，在激活后的卵母细胞中，成熟促进因子浓度降低，不足以支持重构胚的发育。所以，大多采用未激活的MⅡ期卵母细胞作为核受体。
许多试验发现，体内、外成熟的卵母细胞也有差异。当卵母细胞体外培养技术成熟时，用此细胞做核受体，克隆成功率大大提高。如牛、猪、羊等的卵母细胞体外培养技术较成熟，所以，成功克隆的案例较多。但很多物种的体外培养技术还不够完善，需进一步研究。
受体细胞的去核技术对核移植至关重要，主要有以下几种去核方法。
受体拮抗剂实验方法2.2.1 盲吸去核法 此方法是除去第一次减数分裂后卵母细胞形成的纺锤体。此时纺锤体在
第一极体下方，除去第一极体以及下方约1/4的胞质，以达到去核的目的。但目前只有鼠卵母细胞可以观察到纺锤体，因此，称为盲吸法[25]。此方法可以避免荧光染料和紫外照射对卵母细胞不利的影响。但后续研究发现，兔的纺锤体不一定在第一极体下方，可能位于对面，造成盲吸法的效率降低。所以，人们逐渐放弃使用盲吸法去核。
2.2.2 半卵去核法 其是先在极体上部做切口，再从切口处吸出第一极体及1/2的胞质，最后荧光染料Hoechst33342确认。但由于卵母细胞胞质减少而且荧光染料对核受体有不利影响[26]，所以，该去核法使用很少。
2.2.3 切割去核法 它是对半卵去核法的改进。具体方法：沿极体与卵母细胞相交处，将卵母细胞平分，将无极体附着的半卵作为核移植受体细胞[27]。此方法操作的基础是卵母细胞与第一极体黏着在一起，并无透明带，卵母细胞要用植物凝集素（PHA）和链霉蛋白酶预处理。此方法的优点是去核率高，甚至可达90%，没有荧光染料和紫外照射的影响[28]。最具有商业意义的是该法在体视显微镜下就可完成。
2.2.4 高速离心去核法 此方法的原理是卵母细胞的细胞核、质与极体的质量不同，不同转速可使细胞核与极体一同离心排出。具体过程：将卵母细胞用含有细胞松弛素B的培养液培
养，梯度离心后取约1/3的部分作为核受体胞质。它的优点是可一次性处理大量核受体，但还未得到克隆后代，有待进一步验证。
2.2.5 化学诱导去核 该方法可一次性制备大量的卵母细胞，并对操作的技能要求较低，造成的机械性伤害小[29]。方法是先将MⅡ期卵母细胞激活，再在成熟液中添加抑制剂脱羰秋水仙碱，使其排放第二极体。此化学物质使核染质进入第二极体，从而去核。但大量的试验表明，此方法去核率仅为54%，除了小鼠和猪外，未获得其他克隆动物。
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此外，还有功能性去核法，它利用的是紫外线或激光照射使核变性，从而达到去核目的[30]；挤压法是指在卵母细胞发育的过程中，当多数的卵母细胞准备排出第一极体时，破坏透明带并挤压，使极体与尚未分离的核一同排出。
同时，为了能够精确去核，利用卵母细胞MⅡ期染体是由纺锤体连接在赤道板上的原理[31]，通过寻纺锤体定位染体。所以，研究者发现了几种示核法。荧光染料法是使用荧光染料Hoechst 33342处理卵母细胞后，可通过紫外线观察到极体与卵母细胞中期板的相对位置，从而协助去核成功。但染料和紫外线都会对卵母细胞有一定的不利影响，从而妨碍胚胎发育成熟。极化显微镜法是利用构成纺锤体的蛋白有极性的特点，设计了极化显微
镜，可在普通光路下观察到极体和中期板。由于它破坏性小，很多核移植试验采用此方法。
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