miScript PCR 系统操作手册
试剂盒成分：
miScript Reverse Transcription Kit
miScript Primer Assays
miScript SYBR® Green PCR Kit
10x miScript Primer Assay 和10x miScript Precursor Assay是干粉状的，需要稀释。首先短暂离心小管，然后加入550μl TE，pH 8.0，最后在漩涡震荡仪上4-6次。为了保持引物的 活性，在冷冻条件下将稀释的引物分装成小管。
1、在冰上融化RNA，室温下(15–25ºC)融化5x miScript RT Buffer 毛刷制作和RNasefree water 。
先轻弹每个小管使其充分混匀，然后短暂离心以收集管壁和管盖上的液体，最后放置在冰上。
2、在冰上配制reverse-transcription master mix。
配好后混合并放置在冰上。如果miScript Reverse Transcriptase Mix是从-20°C冰箱拿出来的话，那么在使用完毕后立刻放入冰箱。
如果要配制多次反应，先在一个大管中准备Mix，并且多配制10%。
3、将miScript Reverse Transcriptase Mix耐高温无机颜料吧分装到每个小管中，然后加入RNA。
4、在37°C下孵育60分钟
5、在95°C下孵育5分钟以灭活miScript Reverse Transcriptase Mix
6、如果马上进行PCR，讲产物放置在冰上；如果不立刻做PCR，那么将反转录产物放置在-20°C 实验步骤：Real-Time PCR检测miRNA或Noncoding RNA
1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, template cDNA, 和RNase-free water。用前分别混匀各试剂。
2、按下表准备反应mix。
因为PCR反应是热启动反应，所以在配制mix时不须放置在冰上。cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的10%。
3、加入模板cDNA到每个小管中
如果同时检测miRNA和miRNA前体，miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加入量相同（10-20ng）。sdram控制器
4、充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。
5、短暂离心
6、按一下程序进行PCR反应
在每次PCR反应中都要实施融解曲线，以确定反应的特异性和一致性。 miRNA-specific PCR 产物的Tm值大概为74–77°C。
合成的单链miRNA可以用来作为内部的阳性对照。和miRNA同时进行融解曲线分析。也可以进行cDNA合成后再进行标准曲线构建以确定miRNA的拷贝数。
实验步骤：Real-Time PCR for Detection of Precursor miRNA
RNA纯化步骤必须包含基因组DNA去除步骤。并且要求有“no RT”control。
1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix,10x miScript Precursor Assay, template cDNA, 和 RNase-free water。并分别混匀。
2、按下表配制反应mix。
cDNA的加入量不要超过反转录反应体系的10%。
溴代环丙烷3、分装模板cDNA（10-20ng/reaction）到每个小管中。
4、充分混匀反应mix后分装到每个小管。
5、短暂离心
6、按下列程序进行PCR反应
基因组DNA（1ng/reaction）可以用作阳性对照。讲基因组DNA和miRNA前体同时扩增，并比较融解曲线可以确定融解曲线的重复性。
附录：Protocol for Use of Synthetic miRNA as Positive Control in miRNA Detection
1、按下表准备一个20μl体积的反转录反应，使用5μl的合成miRNA（终浓度1010copies/μl）和50ng细菌载体RNA。
2、在37°C孵育60分钟
3、在95°C孵育5分钟后转至冰上
4、加入480μl细菌载体RNA（终浓度1ng/μl），用移液器轻轻上下吹打混匀并短暂离心。
这时稀释的产物浓度为108 copies cDNA/μl
5、用第一步产生的cDNA和载体RNA（1ng/μl）做一下的梯度稀释
6、使用2-6管中的产物2μ语音会议来制作标准曲线。
运输和储存
miScript Reverse Transcription Kit 和 miScript SYBR Green PCR Kit是干冰运输的。两个试剂盒包括所有的试剂和缓冲剂都应该立刻放入-20度冰箱。miScript Primer Assays 和 miScript Precursor Assays 是干粉状室温运输的。储存时无论是干粉状还是稀释后也应该在-20度。避免反复冻融。如果正确处理，其可以保持18个月的优秀性能。
稀释10x miScript Primer Assay 或 10x miScript Precursor Assay时，先短暂离心，再添加550μlTE，Ph 8.0*，最后用漩涡震荡仪震荡4-6次。这样可以得到100次50μl的引物。我们要求对引物进行分装后再冻存，避免反复的冻融引物。
*具体请参见“用户提供的仪器和试剂”
介绍
miScript PCR System 是一个由三个部分组成的系统，它包含了miScript Reverse Transcription Kit, miScript SYBR Green PCR Kit, 和miScript Primer Assay。这个系统能够敏锐的，特异的定量miRNA。
最重要的是确保用于miScript PCR System的RNA包含有miRNA。QIAGEN提供一系列的方案从总RNA中纯化长度在18以上的核苷酸。我们推荐miRNeasy Mini Kit 或 miRNeasy 96 Kit来纯化各种动物/人的组织和细胞中的RNA，或miRNeasy FFPE Kit来纯化FFPE中的组织切片中的RNA。我们推荐在用于miScript PCR System之前，先对RNA进行柱上DNase消化步骤。
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