江西农业学报㊀２０２１，３３（０３）：１７ ２４
ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＪｉａｎｇｘｉ
㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｘｎｙｘｂ．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．１９３８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｘｎｙｘｂ．２０２１．０３．０３
唐丽颖，陈利娜，敬丹，骆翔，李好先，曹尚银∗
㊀
㊀收稿日期：２０２０－１２－０４
基金项目：中国农业科学院科技创新工程 特果树资源与育种 （ＣＡＡＳ－ＡＳＴＩＰ－２０２０－ＺＦＲＩ）㊂
作者简介：唐丽颖（１９９５─），女，河北承德人，硕士研究生，主要从事果树遗传育种研究㊂∗通信作者：曹尚银㊂
（中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州４５０００９）
一次性拖鞋
摘㊀要：以月季石榴为试验材料，结合花粉管通道法和农杆菌介导法进行浸染转化，探究了不同浸染介质及不同授粉方式对坐果率㊁出芽率㊁阳性率的影响㊂对授粉后花粉管的萌发进行观察，发现在授粉后２４ｈ进行菌液浸染可能使菌液深入到花粉管，从而提高转化效率㊂对转化后的１８１９棵实生苗进行ＧＵＳ染和初步筛选，获得了８２棵待检测植株；使用ＰＣＲ扩增技术对转基因阳性植株进行鉴定，得到了１４棵转ＰｇＬＣＢＦ１基因的月季石榴植株㊂对不同处理组合所获得的月季石榴的坐果率㊁出芽率㊁阳性率的研究结果表明：当浸染介质为５％蔗糖㊁授粉方式为授粉后２４ｈ浸染时，月季石榴的遗传转化效果较好㊂ 关键词：月季石榴；遗传转化；花粉管通道法；浸染介质；授粉方式；阳性率中图分类号：Ｓ６６５．４㊀文献标志码：Ａ㊀文章编号：１００１－８５８１（２０２１）０３－００１７－０８
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＤｗａｒｆＰｏｍｅｇｒａｎａｔｅ
（Ｐｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍ）ｂｙＰｏｌｌｅｎＴｕｂｅＰａｔｈｗａｙＭｅｔｈｏｄ
ＴＡＮＧＬｉ－ｙｉｎｇ，ＣＨＥＮＬｉ－ｎａ，ＪＩＮＧＤａｎ，ＬＵＯＸｉａｎｇ，ＬＩＨａｏ－ｘｉａｎ，ＣＡＯＳｈａｎｇ－ｙｉｎ∗
（ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＦｒｕｉｔＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｄｗａｒｆｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ（ＰｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍＬ．ｖａｒ．ｎａｎａ）ｂｙｐｏｌｌｅｎｔｕｂｅｐａｔｈｗａｙｍｅｔｈｏｄｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎｔｈｅｐａｐｅｒ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｆｅｃｔｉｎｇｍｅｄｉａａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎｗａｙｓｏｎｆｒｕｉｔｓｅｔｔｉｎｇｒａｔｅ，ｂｕｄｄｉｎｇｒａｔｅａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｒａｔｅｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｌｅｎｔｕｂｅａｆｔｅｒｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ，ａｎｄｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎ２４ｈａｆｔｅｒｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎｍｉｇｈｔｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｈｅ１８１９ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｉｎｉｔｉａｌｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙＧＵＳｓｔａｉｎｉｎｇ，ａｎｄ８２ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ，ａｎｄ１４ＰｇＬＣＢＦ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｄｗａｒｆｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｆｒｕｉｔｓｅｔｔｉｎｇｒａｔｅ，ｂｕｄｄｉｎｇｒａｔｅａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｒａｔｅｏｆｆｏｕｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｗａｓＭＳ＋５％ｓｕ⁃ｃｒｏｓｅ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｉｎ２４ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ）ｗａｓｂｅｔｔｅｒｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｄｗａｒｆｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ；Ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｐｏｌｌｅｎｔｕｂｅｐａｔｈｗａｙｍｅｔｈｏｄ；Ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ；Ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅ
㊀㊀石榴（ＰｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍＬ．），其原产地为俄罗斯㊁伊朗㊁土耳其㊁阿富汗和高加索等中亚㊁西亚地区，目前在全世界范围内广泛种植［１］㊂石榴在我国有２０００多年的栽培历史，有 天下之奇树，九洲之名果 的美称［２］㊂长久以来，石榴因用途广泛㊁形态美观而受到人们的
喜爱，其集食用㊁药用㊁经济㊁观赏㊁生态价值于一身，在我国被视为重要的经济林树种㊂目前我国除极寒冷地区外均有石榴分布，逐渐形成了几大石榴产区㊂近些年，石榴栽培的经济效益显著，已经成为许多地区脱贫致富
奔小康的特产业㊂截至２０１３年，我国石榴栽培面积约１２万ｈｍ２，年产量１２０万ｔ［３］㊂２０１７年，国内石榴总产量达１６９．７１万ｔ，石榴产品的需求量有１６７．９０万ｔ，同比增长１３．１％［４］㊂
因石榴起源于中亚㊁西亚地区，喜温畏寒，适
宜栽植于气候温暖的地区，就我国而言，淮河以北的石榴栽培区易发生冻害㊂石榴可以耐－１６ħ以上的低温，在－１７ħ下会发生冻害，在－２０ħ下会死亡㊂栽植广泛的 突尼斯软籽 石榴在－１０ħ低温环境中超过１２ｈ就会被冻伤［５］㊂２００２年，山东
省济宁市任城区长沟镇二年生５．３ｈｍ２石榴冻死株率达７０％以上［６］；同年，陕西临潼地区绝对低温为－１２．９ħ，石榴树普遍发生了冻害［７］；２００２年，山
东东明降雪及持续低温６ｄ，最低气温达－１３ħ，４００ｈｍ２石榴受冻率达１００％［８］；２００９年，安徽淮北发生 倒春寒 ，导致约６６６７ｈｍ２的栽培石榴受冻率达９０％以上［９］；２０
０９年，河南荥阳遭遇寒潮侵袭， 突尼斯软籽 石榴约９０％被冻死［１０］；山东枣庄石榴产区于２０１０ ２０１５年间几次遭受冻害，其中２０１２ ２０１３年冻害发生率为３７．２％，２０１５年有７０％ ８０％的石榴受冻害而死［１２］㊂如此严重的冻害，常使产生经济效益的石榴树被冻死，给果农造成了极大的经济损失，严重打击了果农种植石榴的热情与信心㊂石榴冻害已经严重制约了我国石榴生产㊁育种㊁研究等相关工作的开展，阻碍了石榴产业在我国的发展，培育抗冻软籽石榴新品种可以为我国石榴产业发展提供新的思路及方向㊂石榴品种选育的方法主要包括引种㊁实生选种㊁芽变选种㊁杂交育种㊁远缘杂交育种㊁诱变育种㊁倍性育种㊁转基因育种［３］㊂目前，杂交育种仍是果树育种中应用较为广泛且有效的途径，按照常规杂交育种的方式，将遗传基础不同的品种进行人工授粉受精，再经过６ ８代的回交和繁琐的背景选择，最终从后代中选择出具有优良性状的新品种，对于果树来说育种周期较长，育种效率较低㊂因此转基因育种已经逐渐成为新品种培育的重要手段㊂许多植物利用转基因技术育种获得了显著效果，例如：利用转录后基因沉默的现象，将番木瓜最主要的病毒病 环斑病的复制酶基因转入番木瓜基因组中，培育成抗环斑病的转基因番木瓜新品种 华农一号 ［１３］；利用转基因技术提高了大豆的耐旱㊁耐盐㊁耐热性等［１４］，进而提高了大豆的品质与产量；用转基因技术培育出了抗旱抗病抗虫的棉花新品种，其中抗虫棉的培育与普及不仅减轻了棉铃虫的危害，还给农民带来了直接收入［１５］㊂常见的植物转基因技术主要包括农杆菌介导转化法［１６］㊁基因法［１７］㊁花粉管通道法［１８］㊁显微注射法［１９］㊁电激法［２０］等㊂目前较为常用的方法是农杆菌介导转化法和花粉管通道法㊂农杆菌Ｔｉ质粒基因转化法被广泛应用于
双子叶植物中，截至２０１４年，有８０％以上的转基因植株是利用根癌农杆菌转化系统产生的［２１］㊂通过对根癌农杆菌Ｔｉ质粒基因转化法进行改进，使其用于果树育种，适用性广，木本植物也能通过此方法获得
转化的植物细胞㊂发根农杆菌介导的植物转化法
被广泛应用于生根困难的植物中，例如武姣等以
山定子组培苗植株为试验材料，用发根农杆菌诱
导产生发根，并由新发根获得了再生植株［２２］㊂我国科学家周光宇于１９８３年首次提出了花粉
管通道法［２３］㊂此后人们对花粉管通道法进行了大量的研究，包括外源基因转化机理㊁转化技术㊁转化后代的性状鉴定等，这项技术也逐渐被应用到育种工作中㊂近些年来，花粉管通道法已经成功地被应用于棉花㊁玉米㊁水稻㊁大豆等作物的育种工作中，例如：利用花粉管通道法将合成的Ｂｔ基因导入棉花优良品种，获得了转基因植株，形成了抗虫棉体［２４］；王罡等利用花粉管通道法将Ｂｔ毒蛋白基因转入玉米自交系，为抗虫育种提供了优良抗源［２５］；王才林等采用花粉管通道法，将ｂａｒ基因导入水稻，在１４２个后代植株中获得了４个转ｂａｒ基因植株，在Ｔ３代形成了抗除草剂的稳定株系［２６］；将外源半野生大豆的总ＤＮＡ经花粉管通道法直接导入栽培大豆，育成了高产㊁优质的大豆新品种黑生１０１［２７］㊂
农杆菌介导法是目前果树转基因育种中应用
较广泛的方法，也是石榴转基因育种中普遍使用
的手段㊂Ｔｅｒａｋａｍｉ等以矮化石榴叶片和茎段为外
植体进行农杆菌介导的遗传转化，将ＮＰＴⅡ新霉
素磷酸转移酶基因及绿荧光蛋白基因ＧＦＰ导入
了石榴基因组［２８］㊂郭晓丽以突尼斯软籽石榴的愈伤组织作为外植体，用农杆菌介导法转化抗寒基因，得到了转化植株［２９］㊂Ｖｅｒｍａ等用农杆菌介导法转化抗虫基因［Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）］和ＮＰＴⅡ，成功获得了转化植株［３０］㊂农杆菌介导技术发展至今，虽取得了一定的进展，但仍存在遗传转化体系不完善㊁转化效率低等问题［３１］㊂
通风道我们将花粉管通道法与农杆菌介导法结合，
将月季石榴的花柱浸泡在含有ＰｇＬＣＢＦ１目的基因
的农杆菌菌液中，利用该植物在开花㊁受精过程中
形成的花粉管通道将外源基因导入受精卵细胞，
并进一步整合到受体细胞的基因组中，最后随着
受精卵的发育而获得了含有抗寒基因ＰｇＬＣＢＦ１的
抗寒石榴新品种㊂本研究的目的是为育种周期较
短㊁效率较高的石榴转基因育种方法的研究奠定
基础㊂
８１江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３３卷
抗裂抹面砂浆
１㊀材料与方法
１．１㊀试验材料
１．１．１㊀植物材料㊀供试材料为中国农业科学院郑州果树研究所干果课题组试验基地中当年开花的月季石榴实生苗，采用常规栽培管理方法进行管理㊂选择连接ｐＢＩ１２１载体的ＰｇＬＣＢＦ１基因对月季石榴进行遗传转化㊂
１．１．２㊀菌株和质粒㊀感受态细胞Ｔｒａｎｓ－Ｔ１；农杆菌菌株ＧＶ３１０１；试验所用的ＰｇＬＣＢＦ１基因质粒由本实验室保存㊂
１．２㊀试验方法
１．２．１㊀观察花粉管的萌发情况１．２．１．１㊀采集花粉㊀摘取花粉成熟的钟状花，去掉花瓣，待其自然阴干后，将两花相对进行摩擦，收集落下的花粉㊂１．２．１．２㊀授粉㊀用铅笔的橡皮头蘸取收集好的花粉，轻轻点涂在筒状花花柱的柱头上㊂１．２．１．３㊀观察花粉管的萌发㊀分别于授粉后２４㊁３２和４８ｈ取花柱，先用ＦＡＡ固定液固定２４ｈ以上，再用２ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液在６５ħ恒温箱中软化处理７ｈ，待样品为半透明状后用清水冲洗，最后用０．１％水溶性苯胺蓝溶液染过夜［１７］㊂使用ＯｌｙｍｐｕｓＤＰ７１荧光显微镜观察花柱中花粉管的萌发情况㊂
１．２．２㊀用热激法转化Ｔｒａｎｓ－Ｔ１感受态细胞㊀取ｐＢＩ１２１质粒５μＬ，将其加入到５０μＬ处于冰水混合状态的Ｔｒａｎｓ－Ｔ１感受态细胞中，轻弹混匀，置于冰上３０ｍｉｎ；４２ħ水浴热激３０ｓ，立即置于冰上２ｍｉｎ；加入２５０μＬ液体ＬＢ无抗培养基，在２００ｒ／ｍｉｎ㊁３７ħ下培养１ｈ；取１００μＬ菌液，涂在含５０ｍｇ／ＬＫａｎ的固体ＬＢ培养基上，３７ħ培养过夜㊂１．２．３㊀表达载体ＰｇＬＣＢＦ１－ｐＢＩ１２１的构建㊀挑取过夜培养的ｐＢＩ１２
１单菌落于含Ｋａｎ的液体ＬＢ培养基中，在２３０ｒ／ｍｉｎ㊁３７ħ条件下培养１２ｈ，然后用质粒提取试剂盒（ＴＩＡＮＧＥＮ）提取菌液质粒；对质粒进行ＸｂａⅠ酶切，酶切反应体系见表１；酶切完成后，用胶回收试剂盒回收酶切片段；将ＰｇＬＣＢＦ１目的片段连接到表达载体ｐＢＩ１２１上，连接程序为２５ħ１０ｍｉｎ；取连接反应体系（见表２）２５０μＬ，涂在含Ｋａｎ的固体培养基上，３７ħ培养过夜；挑取单菌落进行ＰＣＲ，检测目的片段与表达载体是否连接成功；在连接完成后转化Ｔｒａｎｓ－Ｔ１感受态细胞㊂
表１㊀酶切反应体系
试剂用量／μＬ
ＸｂａⅠ１
１０ˑＭＢｕｆｆｅｒ２
０．１％ＢＳＡ２
ｃＤＮＡ３
ｄｄＨ２Ｏ１２
表２㊀目的片段和表达载体连接反应体系
试剂用量／μＬ
ｐＢＩ１２１Ｖｅｃｔｏｒ１．２
ＰｇＬＣＢＦ１目的片段５．８
５ˑＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ２．０
４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ１．０
ｄｄＨ２Ｏ０１．２．４㊀菌液的制备㊀把带有ＰｇＬＣＢＦ１目的基因的农杆菌接种在ＹＥＰ固体培养基（ＹＥＰ＋Ｋａｎ５０ｍｇ／Ｌ＋Ｒｉｆ２５ｍｇ／Ｌ）上，培养２４ ４８ｈ；挑取单克隆，转接到１ｍＬ液体培养基（ＹＥＰ＋Ｋａｎ５０ｍｇ／Ｌ＋Ｒｉｆ２５ｍｇ／Ｌ）中，在２３０ｒ／ｍｉｎ㊁２８ħ下培养２４ｈ；利用菌液ＰＣＲ方法鉴定出阳性单菌落后，按照１ʒ１００的比例继续在ＹＥＰ＋Ｋａｎ５０ｍｇ／Ｌ＋Ｒｉｆ２５ｍｇ／Ｌ液体培养基中扩大培养，在２３０ｒ／ｍｉｎ㊁２８ħ下培养１２ｈ左右，使ＯＤ６００处于０．８ １．２的最佳范围㊂将获得的农杆菌菌液以４０００ｒ／ｍｉｎ在４ħ下离心１０ｍｉｎ，收集菌体，然后用重悬液将菌体重悬至ＯＤ６００为０．８左右，置于冰上备用㊂重悬液配方为：ＭＳ＋蔗糖５％＋ＳｉｌｗｅｔＬ－７７０．０３％（体积
分数）或蔗糖５％＋ＳｉｌｗｅｔＬ－７７０．０３％（体积分数）㊂１．２．５㊀浸染转化㊀根据花粉管生长的荧光显微观察结果确定合适的转化时机㊂选择试验树上柱头未开裂的筒状花，将重悬好的农杆菌菌液倒入塑料盒中，浸没筒状花２ｍｉｎ；在花柄处涂抹赤霉素１０ｍｇ／Ｌ，套袋保湿２４ｈ，并挂牌标记㊂浸染时针对浸染介质及授粉方式设计了４个不同的处理，如表３所示㊂采用花粉管通道法进行月季石榴遗传转化的流程见图１㊂
表３㊀花粉管通道法设置的不同处理
处理编号浸染介质授粉方式
处理ⅠＭＳ＋５％蔗糖授粉后浸染
处理Ⅱ５％蔗糖授粉后浸染
处理ⅢＭＳ＋５％蔗糖浸染时授粉
处理Ⅳ５％蔗糖浸染时授粉１．２．６㊀转基因植株的催芽播种㊀将获得的石榴种子于４ħ处理１５ ３０ｄ；用清水搓洗表面果肉；用１
９１
㊀３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀唐丽颖等：采用花粉管通道法遗传转化月季石榴的研究
ｍｏｌ／ＬＨＣｌ浸泡１５ｍｉｎ；用清水清洗５ ６遍；用清水浸泡７ｄ左右，１ ２ｄ换水１次，洗净残留果肉㊂
Ａ为月季石榴当年开花；Ｂ为浸染花状态；Ｃ为浸染后套袋保湿２４ｈ；Ｄ为催芽后播种；Ｅ为获得实生苗㊂
图１㊀采用花粉管通道法进行遗传转化的流程
１．２．７㊀转化植株的检测㊀将获得的实生苗以每１００棵为一组混样，进行ＧＵＳ染；将叶片浸没染液后使用真空泵抽气至真空状态并保持２ｈ，于３７ħ孵育１２ ２４ｈ；最后用７５％乙醇脱后进行观察，筛选出叶片显蓝的组合㊂将筛选出的每个组合进行逐棵取样，剪取转基因植株茎尖附近１ ２片嫩叶，采用磁珠法提取基因组总ＤＮＡ㊂使用３５ｓ通用引物为上游引物，根据目的基因序列设计合成下游引物ＣＢＦ１－Ｒ：５ －ＣＴＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＴ⁃ＧＡＴＴＣＣＡＴＡ－３ ㊂采用Ｖａｚｙｍｅ高保真聚合酶２ˑＰｈａｎｔａＭａｘＭａｓｔｅｒＭｉｘ进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ扩增体系见表４，扩增程序：９５ħ３ｍｉｎ；９５ħ１５ｓ，５８ħ１５ｓ，７２ħ３０ｓ，共３５个循环；７２ħ５ｍｉｎ；在４ħ下暂存㊂将扩增产物在１．５％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，然后进行凝胶回收纯化（ＴＩＡＮＧＥＮ，琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒）㊂对凝胶回收产物进行测序
验证，测序委托河南尚亚生物技术有限公司完成㊂
表４㊀ＰＣＲ扩增体系
试剂用量／μＬ
２ˑＰｈａｎｔａＭａｘＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５
３５ｓ通用引物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２
ＣＢＦ１－Ｒ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２
ｇＤＮＡ１
ｄｄＨ２Ｏ２０
２㊀结果与分析
２．１㊀花粉管萌发情况
观察发现，授粉后２４ｈ花粉开始萌发，但并未伸长生长（图２Ａ）；授粉３２ｈ和４８ｈ时花粉管
已伸到子房（图２Ｂ㊁图２Ｃ），因此推测选择授粉后２４ｈ进行菌液浸染可能使菌液深入到花粉管，进而提高转化效率㊂
Ａ：授粉后２４ｈ花粉开始萌发，未到达子房㊂Ｂ：授粉后３２ｈ花粉萌发，开始伸长㊂Ｃ：授粉后４８ｈ花粉伸长至子房㊂
图２㊀石榴授粉后花粉管萌发情况
０２江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３３卷
２．２㊀不同处理对转化后石榴坐果率㊁出芽率㊁阳性率的影响
２．２．１㊀不同处理获得的果实数、种子数及出芽数㊀在本试验中，每处理浸染５朵花㊂由表５可知：处理Ⅰ收获５个果实㊁８１１粒种子，其中３３８粒发芽，获得了２株阳性植株，阳性率为０．２５％；处理Ⅱ收获５个果实㊁５６５粒种子，其中３８０粒发芽，获得了１０株阳性植株，阳性率为１．７７％；处理Ⅲ收获３个果实㊁５２０粒种子，其中３４６粒发芽，获得了２株阳性植株，阳性率为０．３８％；处理Ⅳ未收到果实㊂
表５㊀不同处理对转化后石榴坐果率㊁出芽率㊁阳性率的影响
处理编号浸染介质授粉方式坐果数坐果率／％播种数出芽数出芽率／％阳性数阳性率／％处理ⅠＭＳ＋５％蔗糖授粉后浸染５１００８１１３３８４１．６８２０．２５
处理Ⅱ５％蔗糖授粉后浸染５１００５６５３８０６７．２６１０１．７７
压线板处理ⅢＭＳ＋５％蔗糖浸染时授粉３６０５２０３４６６６．５４２０．３８无尘黑板
处理Ⅳ５％蔗糖浸染时授粉００／／／／／
㊀注：坐果率＝坐果数／浸染花数ˑ１００％；出芽率＝出芽数／播种数ˑ１００％；阳性率＝阳性株数／播种数ˑ１００％㊂２．２．２㊀不同处理对坐果率的影响㊀从表６可以看
出：当浸染介质为ＭＳ＋５％蔗糖时，处理Ⅰ的坐果
率为１００％，处理Ⅲ的坐果率为６０％；当浸染介质
为５％蔗糖时，处理Ⅱ的坐果率为１００％，处理Ⅳ未
收到果实，说明在授粉后２４ｈ浸染有助于提高坐
果率，而浸染介质对坐果率的影响不大㊂
㊀㊀㊀㊀表６㊀不同处理的坐果率比较％
浸染介质
授粉方式
授粉后浸染浸染时授粉
ＭＳ＋５％蔗糖１００６０
５％蔗糖１０００２．２．３㊀不同处理对出芽率的影响㊀由表７可见：当浸染介质为ＭＳ＋５％蔗糖时，处理Ⅰ的出芽率为４１．６８％，处理Ⅲ的出芽率为６６．５４％；当浸染介质为５％蔗糖时，处理Ⅱ的出芽率为６７，２６％，处理Ⅳ未收到果实，说明在浸染介质ＭＳ＋５％蔗糖下，宜采用浸染时授粉方式，而在浸染介质５％蔗糖下，宜采用授粉后浸染方式㊂
㊀㊀㊀㊀表７㊀不同处理的出芽率比较％
浸染介质
授粉方式
授粉后浸染浸染时授粉
ＭＳ＋５％蔗糖４１．６８６６．５４
５％蔗糖６７．２６／２．２．４㊀不同处理对阳性率的影响㊀如表８所示：当浸染介质为ＭＳ＋５％蔗糖时，处理Ⅰ的阳性率为０．２５％，处理Ⅲ的阳性率为０．３８％，相差０．１３个百分点；当浸染介质为５％蔗糖时，处理Ⅱ的阳性率为１．７７％，说明授粉方式对阳性率影响不大，但采用浸染介质５％蔗糖有利于提高阳性率㊂２．３㊀ＧＵＳ染及阳性植株的ＰＣＲ检测结果对１８１９棵植株进行ＧＵＳ染，获得了８２棵显蓝的待检测植株㊂对这些待检测植株进行逐棵取样，提取ＤＮＡ后进行ＰＣＲ检测，３次重复验证，得到了１４个可以扩增出目的基因的样品（图３ 图４），初步证明ＰｇＬＣＢＦ１基因已被整合到月季石榴的基因组中，获得１４棵转基因月季石榴植株㊂进一步的表型观察㊁抗性分析及遗传稳定性等分析验证工作正在进行中㊂
自控温伴热带
㊀㊀㊀㊀㊀表８㊀不同处理的阳性率比较％浸染介质
授粉方式
授粉后浸染浸染时授粉
ＭＳ＋５％蔗糖０．２５０．３８
５％蔗糖１．７７／
３㊀讨论与结论
迄今，石榴转基因育种主要采用农杆菌介导法，存在转化体系不完善㊁转化效率低㊁再生率不高等问题㊂Ｔｅｒａｋａｍｉ等利用农杆菌介导法成功地将目的基因转入石榴基因组，证明农杆菌的感染能力与基因型㊁外植体类型有关，不同基因型㊁类型的外植体在相同条件下遗传转化时转化率存在明显差异［２８］；连红可初步建立了 突尼斯软籽 石榴的瞬时表达体系［３２］；李跃霞的研究表明Ｋａｎ和Ｇｌｕ的质量浓度对愈伤组织的形成影响较大，Ｃｅｆ的质量浓度对材料上杂菌的生长有不同程度的影响［８］㊂吴亚君经研究得出，用石榴组培苗的子叶为外植体进行遗传转化，在共培养３ｄ后未发生褐化，并且能诱导出抗性芽［３３］㊂Ｖｅｒｍａ等以石榴品种 ＫａｎｄｈａｒｉＫａｂｕｌｉ 的胚㊁子叶和茎段为外植体成功进行了遗传转化［３０］㊂赵玉洁分别以石榴组培苗的子叶㊁叶片㊁上胚轴和下胚轴为外植体，进行了遗传转化试验［３４］㊂Ｖｅｒｍａ等在进行农杆菌介导石榴转化时虽成功获得了转化植株，但是转化率仅为２３．０％左右［３０］；郭晓丽［２９］㊁吴亚君［３３］及赵玉洁［３４］在研究中虽然得到了抗性芽，但均未出现转化苗生根的现象；杨选文等对石榴的遗传转化受
１２
㊀３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀唐丽颖等：采用花粉管通道法遗传转化月季石榴的研究
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