前言
过继转移嵌合抗原受体（CAR）T细胞是一项强有力的技术，它彻底改变了免疫的方式。其在难治性和复发性血液系统恶性肿瘤中完全和长期的疗效令人印象深刻，这也为实体肿瘤的开辟了新的可能性。然而，细胞的广泛应用受到了T细胞转染常用病毒载体自身局限的阻碍。在mRNA疫苗和CRISPR/Cas9精准基因编辑的时代，新的无病毒T细胞工程化方法正在成为下一代CAR-T细胞制造的更通用、灵活和可持续的替代方法。 dc-hsdpa病毒载体CAR-T细胞的局限
集成供应链管理系统
迄今为止，临床试验中批准或研究的大多数CAR-T细胞都是利用病毒载体，特别是逆转录病毒和慢病毒载体。病毒载体是具有高效基因转移和长期应用历史的标准化系统，已经证明了在过继性T细胞的安全性。
然而，病毒载体转导长基因的能力受到衣壳的限制。病毒衣壳直径大约为100nm，通常不能容纳超过8-9 kb的基因。然而，随着CAR-T技术的更新迭代，需要转入额外的激活原件或者
不同特异性的CAR，实现更高的药效、安全性和适用性。
芯片处理此外，临床应用的病毒生产通常需要两到三周的时间，在GMP条件下和生物安全2级（BSL2）设施中进行，需要经过熟练培训的员工。这种高成本、复杂性以及个性化的需要最终影响了CAR-T产品的价格，可能达到每人数十万美元，使普通的患者望而生畏。边沟滑模施工>内嵌模组
最后，病毒载体具有固有的免疫原性风险，这是由对载体编码表位的体液和细胞免疫反应引起的，这可能限制转导细胞的效力和持久性。
T细胞工程化的非病毒方法
诺贝尔奖获得者遗传学家芭芭拉·麦克林托克Barbara McClintock在20世纪40年代研究玉米籽粒颜变异时，最初发现了基因组中存在移动序列。玉米中的这些“跳跃基因”当时被称为转座因子（TE）或转座子。 TE分为两类，逆转录转座子和DNA转座子。逆转录转座子使用RNA中间体通过复制粘贴机制移动，代表人类基因组中最常见的转座子类。DNA转座子通过DNA中间体移动，并用于基因转移应用。大多数DNA转座子家族都有一个编码转座酶基因的元件，其两侧是反向末
端重复序列（ITR）。转座酶识别并结合整合到ITRs中的元件，催化将转座因子从其原始位置切除，并将其整合到基因组中的另一个位置。目前，广泛使用的转座子系统，包括Sleeping Beauty（SB）和piggyBac（PB）。非病毒转座子载体具有多功能性、低免疫原性和易于生产的特性。然而，它们通常比病毒的转染效率低。
mRNA的非病毒传递通常通过电穿孔或纳米颗粒实现。一旦进入细胞且不需要到达细胞核，mRNA被翻译成编码的蛋白质，并且通常在2-4次细胞分裂后丢失，这种方法避免了整合载体相关的遗传毒性风险，使该策略成为CAR-T细胞中一个安全的良好方法。
睡美人转座子
在长时间的进化“睡眠”后醒来，鱼类基因组中发现的SB，成为第一个在脊椎动物细胞中显示活性的转座子，从而为基因开辟了新的视野。基于经典的Tc1/mariner DNA II类TE，这些“跳跃”单元能够通过剪切粘贴机制从一个基因组位置转移到另一个基因组位置。SB载体由两个功能组分组成：转座子DNA，它携带有ITR侧翼的感兴趣基因，以及SB转座酶，它识别ITR序列，并将转基因从供体DNA动员到基因组内的受体位点。
与病毒系统相比，这种策略的一大优势是更大的装载能力。插入物的大小与转座机制的效率呈负相关。最佳装载大小不高于6kb。但其升级版本包括两个完整的转座子单元，可以将负载增加到11kb，从而扩充了基于SB载体的克隆能力。此外，当与细菌人工染体（BACs）结合时，SB在人类胚胎干细胞中可以传递高达100 kb的转基因。
在临床应用方面，Cooper等人的团队首次将SB工程化抗CD19 CAR-T细胞应用于临床试验，两项临床试验（NCT00968760、NCT01497184）证实了SB工程化抗CD19 CAR-T细胞在26例B-ALL和非霍奇金淋巴瘤患者自体或异基因造血干细胞移植（HSCT）后作为辅助的安全性。
此外，目前还有正在美国和欧洲使用SB平台进行的CAR-T研究。UltraCAR-T平台基于非病毒系统通过SB载体传递多个基因，利用该平台，正在CD33 CAR和mbIL15（PRGN-3006）的自体细胞，用于r/r急性髓系白血病和高危骨髓增生异常综合征（MDS）。目前，PRGN-3006正在一项剂量递增/扩展研究（NCT03927261）中，评估在r/r急性髓系白血病核高危MDS成年患者中的安全性。初步数据表明，PRGN-3006输注具有良好的耐受性，在接受淋巴滤过的患者中获得50%的缓解率，与CAR-T细胞扩增和持续性相关。
PiggyBac转座子
与SB载体一样，PB系统由PB转座酶（PBase）构成，其形式为mRNA或DNA，以及携带所需基因的单独转染质粒。PB转座子载体的设计以单个开放阅读框（ORF）为特征，其两侧是ITR，PB中的ITR具有特征性的不对称性。转座酶识别转座子两侧的ITR，并通过剪切
粘贴机制将转基因整合到基因组DNA中。PB在哺乳动物细胞中具有比SB更高的转座子动员转座活性，比病毒载体具有更大的装载能力（高达14 kb），并允许通过设计多顺反子盒进行多个转基因传递。
目前，越来越多的临床前数据支持基于PB的CAR-T制造平台的可行性和安全性，这使得该系统能够进入临床试验。在澳大利亚开展的CARTELL试验是一项I期临床研究（ACTRN12617001579381滚动体），旨在研究通过PB转座子系统获得的供体衍生抗CD19 CAR-T细胞的疗效和安全性。早期结果表明，其活性类似于用高应答率病毒载体生成的抗CD19 CAR-T细胞。另外，分别在日本（UMIN000030984）和中国（NCT04289220）进行的两项I期研究正在调查使用PB系统制造的抗CD19 CAR-T细胞的可行性和安全性。在日本的研究中，到目前为止，没有一名患者显示出剂量限制性毒性。一名患者表现出持续9个月的B细胞再生障碍。
虽然转座子工程化的CAR-T细胞在临床试验中都处于初始阶段，但一些已经表现出一定的临床疗效。抗BCMA CAR-T细胞（P-BCMA-101）通过PB平台设计，为了改善转座，其在研究过程中改变了制造工艺，包括使用纳米质粒，以减少骨架尺寸并使ITR更接近。细胞
产物显示出高组成的记忆干T细胞（TSCM）。90名R/R MM患者接受了P-BCMA-101，早期结果显示，初始剂量递增的总有效率（ORR）为57%，与利妥昔单抗联合使用的ORR为73%，毒性很低（NCT03288493）。
mRNA
30多年前，Malone的开创性研究表明，与脂质混合的RNA可以被人类细胞吸收并从中翻译蛋白质。从那时起，RNA就被用于基因工程的多个方面，例如恢复突变基因的功能表达，敲除基因以沉默表达，修改细胞表型或编码抗原。RNA成功表达蛋白质取决于其稳定性和翻译效率。这些特征由顺式作用元件决定，例如5’帽结构、polyA尾、编码序列的组成以及可能存在于分子5’和3’端的非编码区域。
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