高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，更确切的说，本发明涉及高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的方法。

背景技术：

2.苯丙酮酸和4-羟基苯丙酮酸是用途很广泛α-酮酸，在食品、农业和制药行业有非常广泛的应用，可以作为生产抗艾滋病、抗肿瘤、抗糖尿病以及肽类抗生素等药物的原料。苯丙酮酸和4-羟基苯丙酮酸的衍生物在药物和化工领域具有非常重要的应用价值。
3.苯甲醇是一种天然存在且结构最简单的芳香醇，被广泛的应用于食品、化工、医药等领域，目前市场价格为1.4-1.75万元/t。苯甲醇因为具有较低的挥发性以及较强的极性，被广泛的应用于生产胶水、油墨、树脂和油漆等材料。同时，因为苯甲醇具有怡人的芳香味，所以它被广泛的用于合成具有多种风味和香味的酯类产品，如香精、香料，以及具有更高价值的化妆产品。天然苯甲醇可以由多种植物合成，尤其在水果和茶叶中含量较多。然而，即使在这些含量较高的植物中，天然苯甲醇的含量也少于30mg/kg，这使得从植物中提取天然苯甲醇的成本非常高。目前市面上售卖的苯甲醇通常是从石油等化石燃料中提炼得到的，并不能称之为天然苯甲醇。并且该过程消耗了大量的不可再生资源，造成了能源的浪费和环境的污染；2-苯乙醇(2-pe)在鲜花的花瓣和水果中含量较高，具有类似于玫瑰的香味。因为其优良的香味特性常常被用于改变或增强产品的整体风味，例如2-pe可以用来合成在食品和化妆品中常用来增香的芳香酯——丙酸苯乙酯。目前全球2-pe年产量已经超过10000t，而其中大部分是以苯或苯乙烯为原料通过化学的方式合成，价格约为5美元/kg。与化学生产苯甲醇方式类似，该过程不仅会涉及高温、高压等高耗量反应，而且最终的产物中会夹杂大量且较难分离的副产物，给后期产品的纯化过程带来极大困难，从而降低了合成效率并且增加了生产成本；尿黑酸(2,5-二羟基)是一种酚酸，存在于草莓树蜜中。由尿黑酸衍生的一些产物具有较大的价值。其中一个高价值的衍生物是可溶性的黑素，它广泛的存在于自然界中，通常是由多羟基的酚类化合物氧化并聚合而成。这种黑素可以通过吸收紫外线、γ射线，以及清除氧自由基的方式保护细胞，是生产药物和化妆品的原料之一；酪醇是一种具有重要工业和医药价值的芳香醇。酪醇是众多有价值化合物的重要前体。例如，可以利用酪醇合成具有苦味的添加剂改善清酒的风味，还可以用来合成重要的抗氧化剂——羟基酪醇，该化合物可以用于预防心血管疾病和骨质疏松。酪醇最早是在橄榄油和葡萄糖酒中被发现的一种天然芳香醇，由于通过分离提取的方式生产酪醇的成本极高，目前主要以化学的方式合成。但是化学合成的过程复杂且产品收率较低，导致酪醇的价格一直居高不下。因此有必要开发高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的方法，以减少该类物质对化学合成的依赖。
4.本发明的主要目的在于实现高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸的衍生物。以苯甲醇为例对大肠杆菌进行逐步改造以积累苯丙酮酸和4-羟基苯丙酮酸，然后将苯乙醇、尿黑酸和酪醇的生物合成途径导入改造后的宿主体内实现多种苯丙酮酸及4-羟基苯丙
酮酸衍生物的高效生物合成。实验结果表明，经过本方法改造后的工程宿主菌利用葡萄糖在摇瓶中可以生产492mg/l苯甲醇，662mg/l苯乙醇，1.1g/l尿黑酸和2.5g/l酪醇。

技术实现要素：

5.1.本发明的一个目的是改造并提供了高效生产苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的宿主，通过在原始大肠杆菌中敲除合成苯丙氨酸的基因tyrb、aspc和ilve，敲除合成酪氨酸的基因tyra，以及敲除编码丙酮酸激酶的基因pyka和pykf。
6.2.本发明的另一个目的是将合成解除莽草酸途径的反馈抑制以增强产物合成前体的供应。
7.3.本发明的又一个目的是将合成苯甲醇，苯乙醇，尿黑酸和酪醇的路径在改造后的宿主中进行表达以实现四种产物的高效生物合成。
8.4.为了实现上述目的，本发明提供了改造高效生产苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物宿主的方法。
9.5.本发明还提供了生物生产苯甲醇、苯乙醇、尿黑酸和酪醇的方法：向改造后的宿主中导入编码分支酸变位酶(phea)，4-羟基扁桃酸合酶(hmas)，s-扁桃酸脱氢酶(mdlb)，苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlc)的基因生产苯甲醇，导入编码氨基酸脱羧酶(aro10)，乙醇脱氢酶(adh6)的基因生产苯乙醇，导入编码和解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
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)和4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)的基因生产尿黑酸，导入编码导入编码氨基酸脱羧酶(aro10)，乙醇脱氢酶(adh6)和解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
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)的基因生产酪醇。将工程宿主菌进行发酵，从发酵液中取样，利用高效液相谱对中间产物及目标产物的浓度进行分析。
10.6.所述的发酵培养基包括20g/l葡萄糖，3g/l酵母粉，1g/l mops，5g/l nahpo4，1g/l nacl，3g/l kh2po4，1g/l nh4cl，250mg/l mgso4，15mg/l cacl2，溶剂为水。
11.7.最终四种苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的从头合成产量分别为：苯甲醇492mg/l，苯乙醇662mg/l，尿黑酸1.1g/l和酪醇2.5g/l。
12.8.如上文所述，本发明涉及高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物宿主的改造方法，所述方法的特征在于：通过阻断苯丙氨酸和酪氨酸天然合成途径以及调整中心碳代谢实现宿主对苯丙酮酸和4-羟基苯丙酮酸的天然高积累。
13.9.本发明还涉及苯甲醇、苯乙醇、尿黑酸和酪醇的高效生产方法，所述方法的特征在于：通过在上述改造宿主中过表达高效生产四种衍生物的相关酶，从而实现四种衍生物的高效生物合成。
附图说明
14.图1利用代谢工程策略改造宿主并生产苯甲醇、苯乙醇、尿黑酸和酪醇的示意图；
15.图2改造后宿主生产苯甲醇结果图：bw7：bw(pze-phea-hmas-mdlb-mdlc)；
16.图3改造后宿主生产苯乙醇结果图：bw8：bw(pze-aro10-adh6)；
17.图4改造后宿主生产尿黑酸结果图：bw9：bw(pze-hppd,pcs-tyra
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)；
18.图5改造后宿主生产酪醇结果图：bw10：bw(pze-aro10-adh6,pcs-tyra
fbr
)；
19.图6 bw7发酵液中苯甲醇质谱检测结果；
20.图7 bw8发酵液中苯乙醇质谱检测结果；
21.图8 bw9发酵液中尿黑酸质谱检测结果；
22.图9 bw10发酵液中酪醇质谱检测结果。
具体实施方式
23.以下结合附图与实施实例对本发明做进一步说明：
24.本发明中，对表达质粒的种类没有特殊要求，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体，之后不再赘述。
25.实施实例中，大肠杆菌菌株trans5α，bw25113(f’)均为常用大肠杆菌菌株，均可市售获得，其中trans5α用于载体构建，bw25113(f’)则用于发酵用菌株。
26.具体实施例1
27.构建基因工程大肠杆菌bw1
28.1.选择野生大肠杆菌bw25113(f’)作为基础宿主菌，将pkd46质粒导入bw25113(f’)中，在氨苄青霉素抗性的平板上30度培养20小时筛选阳性克隆转化子命名为bw-pkd46，挑取平板上所长的bw-pkd46单克隆，接种到1.5ul/ml氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中30度培养。
29.2.敲除aspc基因同源片段的构建
30.1)本研究中所应用的引物序列，如表1所示
31.表1引物序列表
[0032][0033]
2)整合片段的构建
[0034]
3)以大肠杆菌为模板，p1/p2和p3/p4为引物，pcr扩增得到基因aspc两段同源臂，然后使用p1/p4引物将上下游同源臂和kan片段进行overlap，得到敲除aspc的基础kan片段。进行琼脂糖凝胶电泳，然后采用凝胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化和回收。
[0035]
3.电转化法将敲除aspc基因的同源片段导入1中bw-pkd46菌株中，在菌体中pkd46
的作用下，菌体自身的修复功能使敲除aspc基因的同源片段同源重组替换原基因组中的aspc基因，得到带有卡那霉素和氨苄青霉素的基因工程菌株，在相应抗性的平板上30度培养24小时。
[0036]
4.阳性克隆的筛选，使用p5/p6引物对3中得到的单克隆进行pcr验证，条带大小为960bp即为阳性克隆。
[0037]
5.kan片段的消除，验证成功后将pcp20质粒电转进已将aspc替换为kan片段的宿主菌中以实现kan片段的消除。
[0038]
6.pkd46质粒和pcp20质粒的消除，在无抗生素lb培养基中培养上述带有pkd46质粒和pcp20质粒的基因工程菌，42度培养48小时，使温敏型pkd46质粒和pcp20质粒消除。
[0039]
7.得到了敲除aspc基因的工程菌bw1。
[0040]
具体实施例2
[0041]
构建基因工程大肠杆菌bw2
[0042]
1.将pkd46质粒导入bw1中，在氨苄青霉素抗性的平板上30度培养20小时筛选阳性克隆转化子命名为bw1-pkd46，挑取平板上所长的bw1-pkd46单克隆，接种到1.5ul/ml氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中30度培养。
[0043]
2.敲除tyrb基因同源片段的构建
[0044]
1)本研究中所应用的引物序列，如表2所示
[0045]
表2引物序列表
[0046][0047]
2)整合片段的构建
[0048]
3)以大肠杆菌为模板，p7/p8和p9/p10为引物，pcr扩增得到基因tyrb两段同源臂，然后使用p7/p10引物将上下游同源臂和kan片段进行overlap，得到敲除tyrb的基础kan片段。进行琼脂糖凝胶电泳，然后采用凝胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化和回收。
[0049]
3.电转化法将敲除tyrb基因的同源片段导入1中bw1-pkd46菌株中，在菌体中pkd46的作用下，菌体自身的修复功能使敲除tyrb基因的同源片段同源重组替换原基因组中的tyrb基因，得到带有卡那霉素和氨苄青霉素的基因工程菌株，在相应抗性的平板上30度培养24小时。
[0050]
4.阳性克隆的筛选，使用p11/p12引物对3中得到的单克隆进行pcr验证，条带大小为1100bp即为阳性克隆。
[0051]
5.kan片段的消除，验证成功后将pcp20质粒电转进已将tyrb替换为kan片段的宿主菌中以实现kan片段的消除。
[0052]
6.pkd46质粒和pcp20质粒的消除，在无抗生素lb培养基中培养上述带有pkd46质粒和pcp20质粒的基因工程菌，42度培养48小时，使温敏型pkd46质粒和pcp20质粒消除。
[0053]
7.得到了敲除tyrb基因的工程菌bw2。
[0054]
具体实施例3
[0055]
构建基因工程大肠杆菌bw3
[0056]
1.将pkd46质粒导入bw2中，在氨苄青霉素抗性的平板上30度培养20小时筛选阳性克隆转化子命名为bw2-pkd46，挑取平板上所长的bw2-pkd46单克隆，接种到1.5ul/ml氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中30度培养。
[0057]
2.敲除ilve基因同源片段的构建
[0058]
1)本研究中所应用的引物序列，如表3所示
[0059]
表3引物序列表
[0060][0061]
2)整合片段的构建
[0062]
3)以大肠杆菌为模板，p13/p14和p15/p16为引物，pcr扩增得到基因ilve两段同源臂，然后使用p13/p16引物将上下游同源臂和kan片段进行overlap，得到敲除ilve的基础kan片段。进行琼脂糖凝胶电泳，然后采用凝胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化和回收。
[0063]
3.电转化法将敲除ilve基因的同源片段导入1中bw2-pkd46菌株中，在菌体中pkd46的作用下，菌体自身的修复功能使敲除ilve基因的同源片段同源重组替换原基因组中的ilve基因，得到带有卡那霉素和氨苄青霉素的基因工程菌株，在相应抗性的平板上30度培养24小时。
[0064]
4.阳性克隆的筛选，使用p17/p18引物对3中得到的单克隆进行pcr验证，条带大小为1000bp即为阳性克隆。
[0065]
5.kan片段的消除，验证成功后将pcp20质粒电转进已将ilve替换为kan片段的宿主菌中以实现kan片段的消除。
[0066]
6.pkd46质粒和pcp20质粒的消除，在无抗生素lb培养基中培养上述带有pkd46质粒和pcp20质粒的基因工程菌，42度培养48小时，使温敏型pkd46质粒和pcp20质粒消除。
[0067]
7.得到了敲除ilve基因的工程菌bw3。
[0068]
具体实施例4
[0069]
构建基因工程大肠杆菌bw4
[0070]
1.将pkd46质粒导入bw3中，在氨苄青霉素抗性的平板上30度培养20小时筛选阳性克隆转化子命名为bw3-pkd46，挑取平板上所长的bw3-pkd46单克隆，接种到1.5ul/ml氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中30度培养。
[0071]
2.敲除tyra基因同源片段的构建
[0072]
1)本研究中所应用的引物序列，如表4所示
[0073]
表4引物序列表
[0074][0075][0076]
2)整合片段的构建
[0077]
3)以大肠杆菌为模板，p19/p20和p21/p22为引物，pcr扩增得到基因tyra两段同源臂，然后使用p19/p22引物将上下游同源臂和kan片段进行overlap，得到敲除tyra的基础kan片段。进行琼脂糖凝胶电泳，然后采用凝胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化和回收。
[0078]
3.电转化法将敲除tyra基因的同源片段导入1中bw3-pkd46菌株中，在菌体中pkd46的作用下，菌体自身的修复功能使敲除tyra基因的同源片段同源重组替换原基因组中的tyra基因，得到带有卡那霉素和氨苄青霉素的基因工程菌株，在相应抗性的平板上30度培养24小时。
[0079]
4.阳性克隆的筛选，使用p23/p24引物对3中得到的单克隆进行pcr验证，条带大小为1000bp即为阳性克隆。
[0080]
5.kan片段的消除，验证成功后将pcp20质粒电转进已将tyra替换为kan片段的宿主菌中以实现kan片段的消除。
[0081]
6.pkd46质粒和pcp20质粒的消除，在无抗生素lb培养基中培养上述带有pkd46质粒和pcp20质粒的基因工程菌，42度培养48小时，使温敏型pkd46质粒和pcp20质粒消除。
[0082]
7.得到了敲除tyra基因的工程菌bw4。
[0083]
具体实施例5
[0084]
构建基因工程大肠杆菌bw5
[0085]
1.将pkd46质粒导入bw4中，在氨苄青霉素抗性的平板上30度培养20小时筛选阳性克隆转化子命名为bw4-pkd46，挑取平板上所长的bw4-pkd46单克隆，接种到1.5ul/ml氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中30度培养。
[0086]
2.敲除pyka基因同源片段的构建
[0087]
1)本研究中所应用的引物序列，如表5所示
[0088]
表5引物序列表
[0089][0090][0091]
2)整合片段的构建
[0092]
3)以大肠杆菌为模板，p25/p26和p27/p28为引物，pcr扩增得到基因pyka两段同源臂，然后使用p25/p28引物将上下游同源臂和kan片段进行overlap，得到敲除pyka的基础kan片段。进行琼脂糖凝胶电泳，然后采用凝胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化和回收。
[0093]
3.电转化法将敲除pyka基因的同源片段导入1中bw4-pkd46菌株中，在菌体中pkd46的作用下，菌体自身的修复功能使敲除pyka基因的同源片段同源重组替换原基因组中的pyka基因，得到带有卡那霉素和氨苄青霉素的基因工程菌株，在相应抗性的平板上30度培养24小时。
[0094]
4.阳性克隆的筛选，使用p29/p30引物对3中得到的单克隆进行pcr验证，条带大小为1000bp即为阳性克隆。
[0095]
5.kan片段的消除，验证成功后将pcp20质粒电转进已将pyka替换为kan片段的宿主菌中以实现kan片段的消除。
[0096]
6.pkd46质粒和pcp20质粒的消除，在无抗生素lb培养基中培养上述带有pkd46质粒和pcp20质粒的基因工程菌，42度培养48小时，使温敏型pkd46质粒和pcp20质粒消除。
[0097]
7.得到了敲除pyka基因的工程菌bw5。
[0098]
具体实施例6
[0099]
构建基因工程大肠杆菌bw6
[0100]
1.将pkd46质粒导入bw5中，在氨苄青霉素抗性的平板上30度培养20小时筛选阳性克隆转化子命名为bw5-pkd46，挑取平板上所长的bw5-pkd46单克隆，接种到1.5ul/ml氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中30度培养。
[0101]
2.敲除pykf基因同源片段的构建
[0102]
1)本研究中所应用的引物序列，如表6所示
[0103]
表6引物序列表
[0104][0105]
2)整合片段的构建
[0106]
3)以大肠杆菌为模板，p31/p32和p33/p34为引物，pcr扩增得到基因pykf两段同源臂，然后使用p31/p34引物将上下游同源臂和kan片段进行overlap，得到敲除pykf的基础kan片段。进行琼脂糖凝胶电泳，然后采用凝胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化和回收。
[0107]
3.电转化法将敲除pykf基因的同源片段导入1中bw5-pkd46菌株中，在菌体中pkd46的作用下，菌体自身的修复功能使敲除pykf基因的同源片段同源重组替换原基因组中的pykf基因，得到带有卡那霉素和氨苄青霉素的基因工程菌株，在相应抗性的平板上30度培养24小时。
[0108]
4.阳性克隆的筛选，使用p35/p36引物对3中得到的单克隆进行pcr验证，条带大小为1000bp即为阳性克隆。
[0109]
5.kan片段的消除，验证成功后将pcp20质粒电转进已将pykf替换为kan片段的宿主菌中以实现kan片段的消除。
[0110]
6.pkd46质粒和pcp20质粒的消除，在无抗生素lb培养基中培养上述带有pkd46质粒和pcp20质粒的基因工程菌，42度培养48小时，使温敏型pkd46质粒和pcp20质粒消除。
[0111]
7.得到了敲除pykf基因的工程菌bw6。
[0112]
具体实施例7
[0113]
构建应用质粒生产苯甲醇的工程菌株bw7
[0114]
1.选择本文使用东方木霉来源的4-羟基扁桃酸合酶(hmas)，恶臭假单胞菌atcc12633来源的s-扁桃酸脱氢酶(mdlb)和苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlc)以及大肠杆菌来源的分支酸变位酶(phea)，pcr获得基因片段，接着用核酸内切酶对片段和载体进行双酶切，将
酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因分别插入到质粒pze12-luc(高拷贝)上。获得pze-phea-hmas-mdlb-mdlc，重组质粒(表7)。
[0115]
2.电转法制备bw6的感受态细胞，并将90μl感受态细胞分装于1.5ml的ep管中用于转化。将构建好的重组质粒pze-phea-hmas-mdlb-mdlc 1.5μl加入到含有90μl感受态细胞的离心管中，混合均匀。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，加入lb培养基，并将混合物转移到1.5ml离心管中，复苏60min。之后将菌液涂在含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养。制备成生产苯甲醇的菌株bw7：bw6(pze-phea-hmas-mdlb-mdlc)。
[0116]
3.bw7工程菌株的发酵，在生产苯甲醇的菌株bw7的平板上分别挑取3个单菌落，接到4ml带有氨苄青霉素抗性的液体lb培养基中，37℃下培养12h，之后分别将菌液转移到50ml的发酵培养基中，加入0.25-1mm的iptg进行诱导。之后在每隔12h取样一次，并使用高效液相谱测定苯甲醇浓度。最终产量如图2所示，质谱结果如图6所示。
[0117]
具体实施例8
[0118]
构建应用质粒生产苯乙醇的工程菌株bw8
[0119]
1.选择本文使用酵母来源的氨基酸脱羧酶(aro10)和大肠杆菌来源的乙醇脱氢酶(adh6)，pcr获得基因片段，接着用核酸内切酶对片段和载体进行双酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因分别插入到质粒pze12-luc(高拷贝)上。获得pze-aro10-adh6重组质粒(表7)。
[0120]
2.电转法制备bw6的感受态细胞，并将90μl感受态细胞分装于1.5ml的ep管中用于转化。将构建好的重组质粒pze-aro10-adh61.5μl加入到含有90μl感受态细胞的离心管中，混合均匀。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，加入lb培养基，并将混合物转移到1.5ml离心管中，复苏60min。之后将菌液涂在含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养。制备成生产苯乙醇的菌株bw8：bw6(pze-aro10-adh6)。
[0121]
3.bw8工程菌株的发酵，在生产苯乙醇的菌株bw8的平板上分别挑取3个单菌落，接到4ml带有氨苄青霉素抗性的液体lb培养基中，37℃下培养12h，之后分别将菌液转移到50ml的发酵培养基中，加入0.25-1mm的iptg进行诱导。之后在每隔12h取样一次，并使用高效液相谱测定苯乙醇浓度。最终产量如图3所示，质谱结果如图7所示。
[0122]
具体实施例9
[0123]
构建应用质粒生产尿黑酸的工程菌株bw9
[0124]
1.选择本文使用东方木霉来源的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)和大肠杆菌来源的解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
fbr
)，pcr获得基因片段，接着用核酸内切酶对片段和载体进行双酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因分别插入到质粒pze12-luc(高拷贝)上。同时将解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
fbr
)插入到质粒pcs27(中拷贝)上。获得pze-hppd，pcs-tyra
fbr
重组质粒(表7)。
[0125]
2.电转法制备bw6的感受态细胞，并将90μl感受态细胞分装于1.5ml的ep管中用于转化。将构建好的重组质粒pze-hppd 1.5μl以及pcs-tyra
fbr
2μl加入到含有90μl感受态细胞的离心管中，混合均匀。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，加入lb培养基，并将混合物转移到1.5ml离心管中，复苏60min。之后将菌液涂在含有氨苄青霉素和卡那霉素的平板上，37℃过夜培养。制备成生产尿黑酸的菌株bw9：bw6(pze-hppd,pcs-tyra
fbr
)。
[0126]
3.bw9工程菌株的发酵，在生产尿黑酸的菌株bw9的平板上分别挑取3个单菌落，接到4ml带有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的液体lb培养基中，37℃下培养12h，之后分别将菌液转移到50ml的发酵培养基中，加入0.25-1mm的iptg进行诱导。之后在每隔12h取样一次，并使用高效液相谱测定尿黑酸浓度。最终产量如图4所示，质谱结果如图8所示。
[0127]
具体实施例10
[0128]
构建应用质粒生产酪醇的工程菌株bw10
[0129]
1.选择本文使用酵母来源的氨基酸脱羧酶(aro10)和大肠杆菌来源的乙醇脱氢酶(adh6)，pcr获得基因片段，接着用核酸内切酶对片段和载体进行双酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因分别插入到质粒pze12-luc(高拷贝)上。同时将解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
fbr
)插入到质粒pcs27(中拷贝)上。获得pze-aro10-adh6，pcs-tyra
fbr
重组质粒(表7)。
[0130]
2.电转法制备bw6的感受态细胞，并将90μl感受态细胞分装于1.5ml的ep管中用于转化。将构建好的重组质粒pze-aro10-adh6 1.5μl以及pcs-tyra
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2μl加入到含有90μl感受态细胞的离心管中，混合均匀。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，加入lb培养基，并将混合物转移到1.5ml离心管中，复苏60min。之后将菌液涂在含有氨苄青霉素和卡那霉素的平板上，37℃过夜培养。制备成生产酪醇的菌株bw10：bw6(pze-aro10-adh6,pcs-tyra
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)。
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3.bw10工程菌株的发酵，在生产酪醇的菌株bw10的平板上分别挑取3个单菌落，接到4ml带有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的液体lb培养基中，37℃下培养12h，之后分别将菌液转移到50ml的发酵培养基中，加入0.25-1mm的iptg进行诱导。之后在每隔12h取样一次，并使用高效液相谱测定酪醇浓度。最终产量如图5所示，质谱结果如图9所示。
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表7菌株和质粒
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技术特征：

1.高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的方法，其特征在于：使用red重组的方法将大肠杆菌合成苯丙氨酸的基因tyrb、aspc和ilve，合成酪氨酸的基因tyra和将编码丙酮酸激酶的基因pyka和pykf进行敲除，改造成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物生产的优良宿主，并在优良宿主中进行发酵实验从头合成产物(1)苯甲醇，产物(2)苯乙醇，产物(3)尿黑酸和产物(4)酪醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，四种产物的合成路径所涉及的酶分别为：产物(1)分支酸变位酶(phea)，4-羟基扁桃酸合酶(hmas)，s-扁桃酸脱氢酶(mdlb)和苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlc)；产物(2)氨基酸脱羧酶(aro10)和乙醇脱氢酶(adh6)；产物(3)4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)和解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
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)；产物(4)氨基酸脱羧酶(aro10)，乙醇脱氢酶(adh6)和解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
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)。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，合成路径所涉及的酶来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，分支酸变位酶(phea)，4-羟基扁桃酸合酶(hmas)，s-扁桃酸脱氢酶(mdlb)，苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlc)，氨基酸脱羧酶(aro10)，乙醇脱氢酶(adh6)，4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)，和解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
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)的基因。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，宿主为大肠杆菌。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，生物合成路径在宿主的基因表达元件为下述1)，2)，3)和4)中的一种。1)表达合成苯甲醇的途径，来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，编码分支酸变位酶(phea)，4-羟基扁桃酸合酶(hmas)，s-扁桃酸脱氢酶(mdlb)及苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlc)的基因；2)表达合成苯乙醇的途径，来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，编码氨基酸脱羧酶(aro10)和乙醇脱氢酶(adh6)的基因；3)表达合成尿黑酸的途径，来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)的基因和解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
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)的基因；4)表达合成酪醇的途径，来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，编码解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyra
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)，氨基酸脱羧酶(aro10)和乙醇脱氢酶(adh6)的基因。

技术总结

本发明公开了高效生物合成苯丙酮酸衍生物的方法，涉及的苯丙酮酸衍生物包括苯甲醇、苯乙醇、尿黑酸和酪醇。合成三种产物的途径包含多种酶：分支酸变位酶(pheA)，4-羟基扁桃酸合酶(hmaS)，S-扁桃酸脱氢酶(mdlB)，苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)，氨基酸脱羧酶(aro10)，乙醇脱氢酶(adh6)，4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)，和解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyrA