文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093
谭文辉，李燕萍，许杨
（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。
关键词：原生质体；制备；再生
Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts of
Microorganism
Tan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang
(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint Research
Institute, Nanchang 330047, China)
Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.
Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration
原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。原生质体是由原生质特化而来，细胞内由原生质组成的各种结构，统称为原生质体，它们彼此联系、相互影响而构成一个有机整体，担负着细胞的所有生命活动[1]。 原生质体技术的关键是对细胞壁进行消化，以形成大量的原生质体，并使原生质体能高频率的再生细胞壁，回复到正常细胞状态。当细胞壁去除后，原生质体具有以下特征：一是无细胞壁障碍，可对膜和细胞器进行基础研究，同时可进行遗传操作；二是具有全能性，能在人工条件控制下，进行大量快速繁殖；三是可诱导融合，形成细胞，为体细胞杂交提供实验材料[2]。因此，原生质体技术无论在理论上或实践上都日益受到重视。 1 原生质体的制备
收稿日期：2006-03-29
作者简介：在读硕士，研究方向为食品生物技术
国家自然科学基金资助（30460006）项目，江西省自然科学基金资助（0530081）项目
通讯作者：许杨，教授、博导
人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，效果都不理想。目前，制备原生质体大都是利用酶解法脱去细胞壁。但由于各种微生物细胞壁组成的差异，制备原生质体的条件也各不相同。
1.1 菌龄对原生质体形成的影响
菌体的不同生理状态，直接影响到细胞壁的结构、菌体的代谢水平及菌体的活力等。酵母菌原生质体制备一般取对数生长期的单倍体细胞，此时细胞代谢活跃，生长率高，体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致[3]。孙传宝等报道，对数生长期以前的菌丝体细胞壁结构对降解酶不敏感，酶解过程中更多的是将细胞壁最外层葡聚糖部分降解，造成菌丝体断裂，内含物溢出。到了对数生长后期，菌丝体原生质体释放量较高，但菌丝体体内有大量液泡产生，且原生质膜内皱较多，故释放的原生质体体积较大[4]。
1.2 培养基成分对原生质体分离的影响
培养基成分不同可导致新合成细胞壁结构的差异，这种差异又导致了细胞壁对酶敏感度反应不一，从而使菌丝细胞释放的原生质体量有差异[5]。据报道，在链霉菌（Streptomyces rimosus）的培养基中加入氨基乙酸，可有效促进菌丝体细胞壁形成对裂解酶敏感
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的结构，大幅度提高原生质体释放，且制备的原生质体质量高，从而提高原生质体的再生[6]。
1.3 酶种类对原生质体形成的影响
在制备细菌、放线菌的原生质体时，主要使用溶菌酶作为工具酶。对于酵母菌、霉菌，大型真菌，由于其细胞壁组成比较复杂且存在差异，使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好[7]。据报道，混合使用裂解酶、几丁质酶、纤维素酶和果胶酶，粉红聚端孢（Trichothecium roseum）的原生质体生成率最高为2.8×105个/mL[8]。
1.4 酶浓度对原生质体形成的影响
酶中往往含有对原生质体有害的酶类，随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度
时，必然会影响原生质体的活性；而且，酶浓度过大，细胞脱壁太彻底，必然降低原生质体的再生率[9]。1.5 酶解时间对原生质体形成的影响
不同微生物的最适酶解时间的差异很大。酶解时间过长，对于一些早期释放的原生质体膜有破坏作用，影响原生质体膜的稳定性，导致原生质体破碎或再生率降低[10]。Benjaminiella poitrasii的最佳酶解时间为4小时，此时原生质体产量和再生率最高，时间过短或过长都会导致原生质体的产量和再生率降低[11]。
1.6 酶解温度对原生质体形成的影响
根据酶反应动力学原理，酶解温度直接影响酶促反应的速度。放线菌的最适酶解温度为28~37℃，真菌的最适酶解温度为30~35℃。据N.Balasubramanian 等报道，对粉红聚端孢（Trichothecium roseum）来说，最适酶解温度为28℃，在低于最适酶解温度时，随着温度的升高，原生质体制备率不断提高；高于最适酶解温度时，原生质体的产量明显减少[8]。
1.7 酶解液pH值对原生质体分离的影响
酶解液pH值不仅影响酶的活力和底物的特性，改变溶壁效果，而且影响已脱壁原生质体的稳定性。pH值略偏碱性有利于革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的去除，使溶菌酶可以更好的作用于肽聚糖上ß–(1,4)
糖苷键，促使菌体脱壁。对Monacrosporium megalospo- rum真菌来说，酸性的环境对其原生质体有害，pH7最有利于原生质体的形成[12]。
1.8 渗透压稳定剂的性质及浓度对原生质体产率的影响
合适的渗透压稳定剂，一方面可使原生质体内外的渗透压维持平衡，另一方面对酶的活性也具有一定的促进作用，从而影响原生质体的产量。通常，丝状真菌以无机盐作为稳定剂比较适宜，而酵母菌则用糖或醇做稳定剂较好[13]。对绿木霉(Trichoderma viride)来说，用0.6 mol/L的KCl作为渗透压稳定剂得到的原生质体产量最高，可达4.7×105个/mL[14]。
1.9 预处理方式对原生质体形成的影响
不同预处理方式会引起细胞壁的组成或超微结构发生变化，从而影响裂解酶的敏感度。一方面，对已培养好的菌体，在酶解前用适量硫醇化合物(如ß-巯基乙醇和二硫苏糖醇)预处理能还原细胞壁中蛋白质的二硫键，使分子链切开，酶分子易渗入，从而促进细胞壁的水解及原生质体的释放[15]。另外，EDTA作为螯合剂，可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高霉的脱壁效果，从而提高原生质体的形成率。据报道，对埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）来说，用EDTA 洗后，可以除去对酶解不利的金属离子[16]。另一方面，在原生质体制备前，用适量的青霉素对菌体进行预处理，可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用，有利于原生质体的形成[12]。
1.10 其他影响因素
酶解过程中轻微振荡有利于原生质体的释放，可能与酶充分接触菌丝体或与氧的供应有关。此外，还有一些影响因素如：菌体浓度、分散程度和遗传性等。
2 原生质体的再生
原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生。不同微生物的原生质体最适再生条件存在一定的差异。
2.1 培养方式对原生质体再生的影响
张力计算不同的菌种要求不同的再生培养方式，用固体培养法再生原生质体优于液体培养法。王波等报道，双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的原生质体适合于固体单层再生培养，单层再生培养基的再生菌落数较双层再生培养基的高72.0 %[17]。
2.2 培养基对原生质体再生的影响
在再生培养基中会添加一些营养物质，这些物质可能是作为细胞壁合成的前体物质，也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢，加速细胞壁合成的作用。通常，添加酵母膏、蛋白质、糖类或氨基酸到真菌的再生培养基中，而细菌、放线菌的再生培养基中常添加水解酪蛋白、血清白蛋白
、氨基酸和琥珀酸钠等。对白绢菌（Sclerotium rolfsii）来说，在再生培养基中添加0.6 mol/L的蔗糖，原生质体的再生率最高，可达26 %[18]。
2.3 菌龄对原生质体再生的影响
菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全，营养供给不足，再生能力也较低。
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菌龄长的原生质体再生率高，且再生时间远比菌龄短的原生质体再生时间短，可能是含有细胞核和其他细胞物质数量多的缘故[19]。
2.4 渗透压稳定剂对再生率的影响
渗透压稳定剂对再生率的影响主要可能还是对原生质体稳定的影响。王殿夫等曾经报道，就形成率而言，以糖及糖醇类作为渗透压稳定剂比无机盐更有利于原生质体的再生。这可能是由于糖和糖醇对原生质体的保护作用[20]。
2.5 Ca2+对原生质体再生的影响
Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。王建华等报道，原生质体膜外在蛋白上二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强，这种维持稳定性的效果大小与膜表面分子数量的多少呈正比例关系[21]。
2.6 酶解参数对原生质体再生的影响
原生质体制备时的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大。酶浓度的高低也影响原生质体的再生，因为在过高浓度的酶制备原生质体时细胞受损伤较大，失去了重新建成原来细胞所必要的因子，影响原生质体的再生。酶解时间与原生质体形成率成正比，与再生率成反比[22]。原因是酶解时间越短，细胞壁脱壁越不完全，较易再生出细胞壁，酶解时间越长，脱壁越完全，原生质膜易被酶液破坏，再生较困难。2.7 原生质体的贮存对再生的影响
由于原生质体比较脆弱，在各种高渗液和不同温度下保存，其再生能力普遍都会下降。据徐进等报道，捕食线虫真菌（Nematode-trapping）的原生质体经过-20 ℃冰冻后或经4 ℃放置数天后，仍有部分可以再生(再生率低于0.1%)[23]。
2.8 其他影响因素
原生质体的再生率还受菌株本身的性质、菌体预处理方式等多种因素影响。
3 小结
在原生质体制备和再生的过程中，应该综合考虑原生质体制备和再生的影响因素，达到较高的原生质体再生率和最佳的原生质体制备条件的统一。
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