DOI：10.3969/j.issn.l674-2591.2021.01.008•基础研究•嘌吟受体P2Y2在骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中的作用 李文凯，张英驰，杨勇，吴华
［摘要］目的探讨嘌吟受体P2Y2在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨和成脂分化中的作用及其分子机制。方法体外分离培养大鼠BMSCs，取第3代细胞进行实验。使用实时定量聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测BMSCs成骨和成脂分化基因的表达，茜素红染和油红O染分别检测钙结节和脂滴的生成。使用三磷酸尿苷(uridine triphosphate, UTP)作为P2Y2受体激动剂，使用P2Y2和P2Y4受体小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、P2Y6受体拮抗剂评估P2Y2受体在UTP对BMSCs成骨和成脂分化影响中的作用。蛋白免疫印迹(Westemblot)法检测UTP及P2Y2受体对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路的影响。结果与对照组相比较，25和125^mol/L浓度的UTP可以使BMSCs细胞成骨特异性转录因子(RUNX2)的表达分别下降19%和62%、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的表达分别下降56%和55%、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达分别下降26%和70%，使细胞过氧化物酶体增生物激活受体Y(peroxisome prolifer-ator activated receptor了,PPARy)分别增加38%和52%、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein4, FABP4)分别增加17%和29%、降脂素(Adipsin)分别增加54%和93%，且不影响BMSCs细胞增生。此外，与对照组相比较，125zmo"浓度
的UTP可以使BMSCs细胞钙结节生成减少64%，脂滴形成增加40%。沉默P2Y2受体后UTP对BMSCs分化的影响明显减弱，而沉默P2Y4受体或抑制P2Y6受体则没有影响。UTP可激活BMSCs的ERK1/2信号通路，沉默P2Y2受体后UTP对ERK1/2信号通路的激活作用明显减弱。ERK1/2信号通路的阻滞剂U0126可以明显减弱UTP对BMSCs抑制成骨和促进成脂的作用。结论UTP通过激活P2Y2受体及ERK1/2信号通路促进BMSCs成脂分化、抑制其成骨分化。
［关键词］P2Y2受体；三磷酸尿苷；骨髓间充质干细胞；成骨分化；成脂分化
中图分类号：R681文献标志码：A
Roles of purine receptor P2Y2in osteogenic and adipogenic
differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells
LI Wen-kai,ZHANG Ying-chi,YANG Yong,WU Hua
Department of Orthopedics,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of
Science and Technology，Wuhan430030，China
［Abstract］Objective To investigate the roles of purine receptor P2Y2in osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)and the underlying mechanism.Methods BMSCs were isolated from rats and cultured in vitro，and the third passage cells were taken for experiment.Real time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)was used to detect the gene expression of osteogenic and adipogenic differentiation of
基金项目：国家自然科学基金(51807078)
作者单位：430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科
通信作者：吴华，E-mail:wuhua360@aliyun
BMSCs.Alizarin red staining and oil red O staining were used to detect the formation of calcium nodules and lipid droplets. Uridine triphosphate(UTP)was used as P2Y2receptor agonist.Small interfering RNA(siRNA)of P2Y2and P2Y4receptor,antagonist of P2Y6receptor were used to evaluate the role of P2Y2receptor in differentiation of BMSCs induced by UTP.Western-blot was used to detect the effects of UTP and P2Y2receptor on mitogen activated protein kinase(MAPK) pathway.Results Compared with the control group,25and125Rmol/L UTP decreased the expression of osteogenic specific transcription factor(Runx2)，alkaline phosphatase(ALP)and osteopontin(OPN)
in BMSCs by19%and62%，56% and55%,26%and70%,respectively.25and125(xmol/L UTP increased the expression of peroxisome proliferator activated receptor y(PPARy),fatty acid binding protein4(FABP4),adiposin in BMSCs by38%and52%,17%and29%, 54%and93%,respectively.In addition,125(xmol/L UTP reduced the formation of calcium nodules by64%and increased the formation of lipid droplets by40%compared with the control group.Silencing P2Y2receptor significantly weakened the effect of UTP on differentiation of BMSCs，while silencing P2Y4receptor or inhibiting P2Y6receptor had no effect.UTP activated ERK1/2signaling pathway of BMSCs,and the effect was significantly weaken after P2Y2receptor was silenced. U0126,a blocker of ERK1/2signaling pathway,significantly attenuated the effect of UTP on osteogenic and adipogenic differentiation of BMSCs.Conclusion UTP promotes adipogenic differentiation and inhibits osteogenic differentiation of BM-SCs by activating P2Y2receptor and ERK1/2signaling pathway.
[Key words]P2Y2receptor；uridine triphosphate；bone marrow mesenchymal stem cells；osteogenic differentia-tion；adipogenic differentiation
骨质疏松症是一种以骨量持续丢失、骨代谢加快和容易发生骨折为特征的疾病茁。骨髓间充质干纟田月包（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）功能紊乱是骨质疏松的发病机制之一⑵。BMSCs是一种具有多向分化潜能的细胞，可以向骨、软骨和脂肪分化，是一种骨组织工程的种子细胞
［3］o目前认为促进BMSCs成骨分化的因子同时也会抑制其向成脂分化，反之亦然［3-5］o 一旦BMSCs的成骨和成脂分化失衡，如骨髓内的脂肪含量增加，则导致成骨细胞凋亡，进而使骨吸收增加导致骨质疏松［6］。
嘌吟受体通路已被证实在调节骨代谢平衡中有重要作用，嘌吟受体包括P2X和P2Y受体，各种亚型在不同骨相关细胞中均有表达⑺。其中嘌吟受体P2Y2是细胞膜上的一类Gq蛋白偶联受体，与激动剂结合后可激活磷脂酶C，并诱导细胞内钙释放⑻。文献报道肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor a,TNF-a）通过促进P2Y2受体在雌激素缺乏性骨质疏松症中抑制BMSCs的成骨分化⑼。大鼠P2Y2受体过度表达会显著减少成骨细胞形成的骨矿化结节，并增加破骨细胞的形成［10］。本研究旨在探讨嘌吟受体P2Y2在BMSCs 成骨和成脂分化中的作用及其分子机制。
材料与方法
实验动物、试剂与仪器
4周龄雄性SD大鼠购于湖北省实验动物研究中心，实验动物合格证号：SCXK（鄂）2008-0005。UTP、U0126、MRS2578（P2Y6受体拮抗剂）购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；GAPDH、ERK、JNK及P38抗体购于Cell Signaling Technology公司；RIPA蛋白裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司；反转录试剂盒及RT-PCR试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；Trizol试剂
盒、Lipofectamine3000、Opti-MEM、引物设计及合成购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CCK-8试剂盒、油红0和茜素红S购于武汉博士德生物工程有限公司；电泳仪、半干电转膜仪、凝胶成像仪、实时荧光定量PCR 仪购于美国Bio-Rad公司；SD大鼠骨髓间充质干细胞普通培养基、成骨和成脂诱导培养基购于广州赛业生物科技有限公司。
BMSCs细胞的培养
本实验经过华中科技大学附属同济医院实验动物伦理委员会批准。将4周龄雄性SD大鼠安乐死后。无菌状态下用SD大鼠BMSCs培养液反
复冲洗双侧股骨和胫骨骨髓腔，将冲洗液反复吹打混匀后放入细胞培养箱内培养，每隔3d换一次细胞培养液。当细胞生长汇合达75%时按1:3比例进行传代。取第3代细胞备用。当对BMSCs 进行成骨或成脂诱导时则使用成骨或成脂诱导培养基培养。
RNA提取及RT-qPCR检测
细胞RNA的提取按照Trizol试剂盒操作说明书进行，提取后使用分光光度计检测RNA的浓度 及纯度。反转录及RT-qPCR操作见参考文献[11]。荧光定量PCR反应：按RT-PCT试剂盒操作说明书进行，于八联管中加入引物、cDNA、混合体系及无RNA酶纯水，共10zL，每个样品设3个副孔，瞬时离心；置
于荧光定量PCR仪上（Bio-rad IQ5）,95°C预变性1min,95X变性15s,58X退火、延伸、检测荧光，机器预设溶解曲线程序。各基因的引物序列见表1。
蛋白提取及Western blot法检测
细胞用PBS洗3次，每孔（6孔细胞培养板）加入100zL RIPA细胞裂解液，冰上裂解30min，收集裂解液于1.5mL离心管中，离心半径10cm,12000r/min,4C，离心15min，吸取上清，即为蛋白质溶液。用BCA法测蛋白浓度，调整浓度后加入上样缓冲液，99X变性5min，于—20C冰箱中保存。取20zg蛋白于12%的SDS-PAGE胶中电泳，浓缩胶，恒压75V, 50min，分离胶恒压120V, 1.5h；恒流200mA 2h将蛋11转至直径为0.45zm的PVDF膜上，用5%脱脂奶粉（TBST配置）封闭1h；4C条件下孵育一抗过夜。用TBST洗膜（每次洗15min，共洗3次）后，37X孵育二抗1h，再用TBST洗膜（每次洗15min，共洗3次）后，暗室内曝光。
CCK-8试剂盒检测细胞增生
将对数期BMSCs细胞以5000个/孔的密度种植于32孔细胞培养板中，加入不同浓度梯度的UTP（5、25、125zmol/L），每个梯度设5个复孔。分别在加药后的第3、5和7天检测。检测时每孔加入10zL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，在450nm测定每孔的吸光度值。
茜素红和油红O染
将BMSCs分别用成骨诱导培养基或成脂诱导培养基培养21d，吸去培养基，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3遍，4%多聚甲醛固定细胞15min，双蒸水洗1遍，分别用4%茜素红或油红O染液染30min，双蒸水洗2遍，显微镜下观察拍照。
siRNA转染实验
混杂序列RNA、P2Y2和P2Y4siRNA均由瑞博（中国广州）公司设计。根据siRNA使用说明书，将BMSCs以50000个/孔的密度种植于6孔细胞培养板上，待细胞汇合到80%时开始转染。转染液包含Lipofectamine3000（7.5zL/孔）、100nmol/L的siRNA和250zL Opti-MEM。将细胞与转染液混合后加入1750zL的Opti-MEM在37X下培养，分别在转染后24、48、72和96h 后使用RT-qPCR检测转染效果。
表1实时荧光定量PCR引物序列
Table1List of specific primer sequences used in RT-qPCR
基因上游引物（5'-3‘）下游引物（5'-3‘）
GAPDH GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG RUNX2GCACCCAGCCCATAATAGA PPAR y CCTTTACCACGGTTGATTTCTC ALP CAAGGACCAACTACAACCA OPN CCTGGACCTCATCAGC
ATTT Adipsin CACGTGTGCGGTGGCACCCTG Fabp4GCGTAGAAGGGGACTTGGTC ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA TTGGAGCAAGGAGAACCC GGCTCTACTTTGATCGCACTTT AGGGAAGGGTCAGTCAGGTT GGAGAC AGGAGGCAAGG CCCCTGCAAGTGTCCCTGCGGT TTCCTGTCATCTGGGGTGATT
GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；RLNX2：成骨特异性转录因子；ALP：碱性磷酸酶；OPN：骨桥蛋白；PPARy：过氧化物酶体增生物激活受体Y；Adipsin：降脂素；FABP4：脂肪酸结合蛋白4
统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件对数据进行处理分析, 计量资料用均数士标准差（%±s ）表示。使用ANOVA
方差分析，以P <0.05为差异有统计学意义。结 果
UTP 对BMSCs 增生和分化的影响
将不同浓度的 UTP （5、25、125 zmol/L ） 与BMSCs 共同培养3~7 d, CCK-8检测结果显
示3个浓度的UTP 对BMSCs 细胞增生均没有影 响（图1A ）。将以上3个浓度的UTP 与BMSCs
分别在成骨和成脂诱导培养基中培养14 d, RT- qPCR 检测发现，与对照组相比，25和125 zmol/L
的 UTP 均可 减少成骨相 关基因 （ RUNX2、 ALP 和OPN ）表达（图1B ），增加成脂相关基因
（PPAR y 、FABP4 和 Adipsin ）的表达（图 1C ）,
其中以125 zmol/L 的浓度影响最显著。因
125 zmol/L 的UTP 对BMSCs 分化的影响最显
著，且对其增生没有影响，后面实验均使用
125 zmol/L UTP 进行。
UTP 对BMSCs 的钙沉积和脂滴生成的影响将UTP 和BMSCs 分别在成骨和成脂诱导培
养基中培养21 d 。茜素红染和油红O 染结果
塑料槽板
显示，与对照组比较，UTP 可以明显的减少钙结
蒸汽回收机
节的数量（图2A ）、增加脂滴生成（图2B ）。
嘌吟受体P2Y2在UTP 调节BMSCs 分化中
的作用
分别使用P2Y6受体拮抗剂MRS2578
（1 zmol/L ）、P2Y2 和 P2Y4 受体 siRNA , RT- qPCR 检测发现P2Y2和P2Y4受体siRNA 转染
48 h 后的基因沉默效果最好（图3A ）。RT-qPCR
检测发现使用MRS2578和P2Y4受体siRNA 后,
UTP 对BMSCs 分化指标的影响并没有变化（图
3B ）；而P2Y2受体siRNA 则可明显减弱UTP 对除氟滤料
BMSCs 分化的影响（图3C ）。
UTP 和P2Y2受体对MAPK 信号通路的影响将UTP 与BMSCs 分别孵育0~60 min 后提取蛋
白， Western blot 法检测显示在加入 UTP 5 min 后， ERK1/2的磷酸化表达就显著增加，而JNK 和P38
未见明显磷酸化改变（图4A ）。为验证UTP 是否
通过P2Y2受体激活ERK1/2通路，采用siRNA 阻 滞P2Y2受体后再加入UTP , Western blot 法检测结
果显示UTP 引起的ERK1/2的磷酸化几乎被P2Y2
旋转机械故障诊断
受体siRNA 完全抑制（图4B, C ）。
ERK1/2信号通路在UTP 影响BMSCs 成骨
和成脂分化中的作用
纳米网将ERK1/2通路抑制剂U0126作用于BMSCs
0.5 h 以阻断ERK1/2信号通路，接着用UTP 刺
o o
o O
(Um
09岂
赳『
■ UTP 5 pmol/L UTP 125 pmol/L
*坦聚夜买
*坦
聚夜买
□对照组
■ UTP 5 jimol/L
□ UTP 25 pmol/L ■ UTP 125 pmol/L
图1 UTP 对BMSCs 增生和分化的影响
Fig 1 Effects of UTP on proliferation and differentiation of BMSCs
A ： CCK-8检测细胞增生；
B ： RT-qPCR 检测成骨分化基因的相对表达量；
C ： RT-qPCR 检测成脂分化基因的相
对表达量；与对照组比较，“ P<0.05； A ：吸光度；UTP ：三磷酸尿苷；BMSCs ：骨髓间充质干细胞；RUNX2： 成骨特异性转录因子；ALP ：碱性磷酸酶；OPN ：骨桥蛋白；PPAR y ：过氧化物酶体增生物激活受体Y ； FABP4： 脂肪酸结合蛋白 4； Adipsin ：
降脂素
图2UTP对BMSCs钙结节和脂滴生成的影响
Fig2Effects of UTP on formati:on of calcium nodules and lipid droplets of BMSCs A：钙结节的相对表达量；B：脂滴的相对表达量；与对照组比较，-P<0.05；UTP：三磷酸尿苷;
BMSCs：骨髓间充质干细胞
□对照组・UTP
□对照组・UTP
图3嘌吟受体P2Y2在UTP调节BMSCs分化中的作用
炸薯条机
Fig3Roles of P2Y2receptor in the differentiation of BMSCs induced by UTP
A：RT-qPCR检测P2Y2和P2Y4受体siRNA的沉默效果；与对照组比较，T<0.05；与48h比较，*P<0.05；B：RT-qPCR检测成骨分化基因的相对表达量，与对照组比较，•P<0.05；C：RT-qPCR检测成脂分化基因的相对表达量，与UTP组比较，-P<0.05；BMSCs：骨髓间充质干细胞；UTP：三磷酸尿苷；siRNA：小干扰RNA；RUNX2：成骨特异性转录因子；ALP：碱性磷酸酶；OPN：骨桥蛋白；PPAR7：过氧化物酶体增生物激活受体Y;FABP4：脂肪酸结合蛋白4；Adipsin：降脂素
激BMSCs，RT-qPCR检测结果显示U0126明显减 弱UTP对BMSCs成骨和成脂基因表达的影响（图5）。
讨论
BMSCs的成骨和成脂分化失衡是骨质疏松的重要病理机制之一⑵，调节BMSCs的成骨和成脂分化可以作为骨质疏松的一个靶点和途径。本研究观察UTP及P2Y2受体在BMSCs成骨和成脂分化中作用及其相关机制。P2Y2受体是细胞膜上的一类Gq蛋白偶联受体，目前尚没有特异性的P2Y2受体
激动剂。而UTP 可以激活P2Y2和P2Y4受体，当UTP水解为UDP后又可以激活P2Y6受体[12]o因此，本研究选择使用UTP作为P2Y2受体的激动剂。此外本研究还使用用了P2Y6受体的拮抗剂MRS2578、P2Y2和P2Y4受体siRNA，通过分别阻滞P2Y2、P2Y4和P2Y6受体验证UTP通过哪个P2Y受体调节BMSCs的分化。研究结果显示UTP通过P2Y2受体激活ERK1/2信号通路
,
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议