硝基呋喃检测试剂盒 硝基呋喃类（Nitrofurans）药物是一种广谱抗生素，因价格较低且效果好，而广泛用于畜禽及水产养殖业，以由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疖疮、赤鳍病、溃疡病等。但由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用,1995年起欧盟禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用，并严格执行对水产中硝基呋喃的残留检测，2002年美国亦随之制定相应法规。 硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，无法检测。但其代谢产物因和蛋白质结合而相当稳定，故利用代谢物的检测可反应硝基呋喃类药物的残留状况。硝基呋喃类（Nitrofurans）药物常见有以下四种：呋喃唑酮（鹰眼监控系统Furazolidone）呋喃咜酮(Furaltadone) 硝基呋喃托英(Nitrofurantoin) 硝基糠腙(Nitrofurazone)，代谢产物分别为AOZ、AMOZ、AHD、SEM。呋喃唑酮为硝基呋喃类药物中最具代表性的一种。 目前普遍利用LC-UV、LC-MS、LC-MS/MS进行检测，与之相比，酶联免疫检测法具有经济、方便等优点。本公司研制的呋喃唑酮代谢物AOZ酶联免疫检测试剂盒，经衍生萃取完毕后，只需50分钟即可完成检测，对鱼肉、虾肉检测灵敏度可达0.1ppb 反应原理 本产品主要是利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理来进行的。在整个反应当中,样品中AOZ含量越多，反应呈就越淡。反之，样品中AOZ含量越少，则呈越深。试剂盒组 成1、微量测试孔：每条8孔，每板12条2、AOZ标准溶液：0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35 ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶3、10倍浓缩缓冲液：一瓶，50ml/瓶4、10倍浓缩萃取无人机管控/清洗液：一瓶，50ml/瓶5、衍生试剂： 一瓶，12 ml/瓶6、浓缩酶标记物：一瓶，100μl/瓶7、底物溶液：一瓶，12 ml/瓶8、反应终止液：一瓶，13 ml/瓶使用说明A、注意事项1、使用前先将AOZ标准溶液6瓶，浓缩萃取稀释/清洗液，浓缩缓冲液，衍生试剂，浓缩酶标记物，底物溶液及微量测试孔条置于室温下，回温30分钟。2、原倍缓冲液配制用蒸馏水将10倍浓缩缓冲液以1： 9的比例稀释(即1mL浓缩液+9mL蒸馏水)，即可作为样品萃取步骤中调节PH值用，原倍缓冲液一旦配制完成，请确实放置4℃储存。（10倍浓缩缓冲液请确实回温后使用，并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解）3、原倍萃取/洗涤液配制 用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液/清洗液分别以1： 9的比例稀释(即1mL浓缩液+9mL蒸馏水)，即可作为样品萃取稀释液与微孔板清洗液。（10倍浓缩萃取DNA变性与杂交/洗涤液请确实回温后使用，并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解）4、衍生试剂配制于DMSO中，4oC保存会有结冰现象，若提供微温（30oC）的水浴将有助于加速溶解。此外，为避免DMSO挥发造成操作者不适，请于通风柜内添加此试剂。5、酶标记物配制，取25μl浓缩酶标记物加入7.5ml稀释好的原倍萃取/洗涤液，混匀。（足够半板使用）6、回温后，取出所需微量测试
孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好，置于4oC保存。B、样品制备待测物为鱼、虾肉等，依以下方法进行处理a.将1克样品剪碎后放入50 ml离心管中。b. 加入4mlH2O, 0.5ml 1M HCL, 100μl衍生试剂，震荡混合约1分钟，置37℃烘箱，静置过夜（16小时）。c.加入5ml原倍缓冲液，0.4ml 1M NaOH, 5ml乙酸乙酯，震荡混合约1分钟。d.离心10分钟(3000rpm)，取2ml上清液(乙酸乙酯)至10ml玻璃管中，于50oC下氮气吹干。e.于此玻璃管中加入正己烷1 ml，先将残余物完全溶解后人工呼吸器(若未能完全溶解，可能会导致回收率降低)，再加入0.8 ml原倍萃取/清洗液，震荡约1分钟。f.将玻璃试管置80－100℃热水浴约3分钟，将有效减少水相与有机相之间乳化现象。g.离心10分钟(3000 rpm)，用吸管吸去上层液(正己烷) 弃掉。再吸取下层液(水层)备用。h.zyzq计算结果时务必将稀释倍数（2×）换算回去。C、操作步骤1、于适当微孔中分别加入50mL标准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。2、在另外的微孔中加入50mL 已完成前处理的样品溶液。3、再于每一微孔中另再加入100mL已稀释的酶标记物。4、轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育30分钟。5、将微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次。6、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，轻敲盘子四周，使其充分混合。8、于室温下避光静置温育20分钟。9、于每一微孔中加入100mL
反应终止液。10、用酶标仪于波长450nm下判读。 D、判定1. 计算B/B0值。用样品或标准液吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B0)再乘以100%。2. 以B/B0值为纵坐标，以标样浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线。3. 根据每个样品的B/B0值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。4. 由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数2。E、标准曲线 F、灵敏度 样品灵敏度（ppb）鱼肉0.1虾肉0.1G、特异性针对以下硝基呋喃类抗菌剂进行交叉反应之测试，结果如下：AMOZ <0.1%SEM <0.1%AHD <0.5%H、再现性针对TABP之AOZ检测试剂盒精密度测试，重复6次，所得不同浓度标准溶液的吸光值变异系数(%CV)如图2所示，显示TABP之AOZ试剂盒有很高的再现性: I、回收率样品AOZ浓度回收率(%)鱼肉(0.3ppb)90-120虾肉(0.3ppb)90-120J、可能出现的问题与解决办法1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。a.原因：未加入酶标记物。解决办法：请确实按照操作步骤进行。b.原因：试剂盒内容物未能充分 回。解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。c.原因：室温太低。解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间(>30分钟)。d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。e.原因：试剂盒已过有效期限。解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。b.原因：操作时间拖太久。解决办法：请在方法熟练后再进行操作。c.原因：微孔间相互污染。解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。解决办法：请使用已校正过的移液，并确保其与吸头之间有高度密合性。e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。a.原因：室温太高(>25℃)。解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间(<30分钟)。b.原因：底物溶液受到污染。解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝，请不要再使用。c.钢筋塑料垫块原因：反应时间超过太久。解决办法：请控制反应时间。d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。解决办法：
使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。解决办法：请参考原因：添加样品或酶标记物的量不一致。解决办法： 请参考2-d.
前处理试剂盒优点（专家鉴定意见）
1，采用新型衍生剂，用衍生化溶液直接上柱提取净化技术，提取净化由原先的2小时缩短到半个小时，衍生化时间由行标的16小时缩短到1个小时。
2，降低了检测成本。
3，检测方法准确、可靠、灵敏度高。
4，新的方法突出了新的机理，前处理简化掉行标中南控制的衍生化溶液酸度调节和繁琐的提取净化操作
方法原理：试样中残留的硝基呋喃类代谢物用硝基呋喃类代谢物快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、衍生化、净化后用UPLC/MS/MS进行检测，外标法定量。
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