钢制汽车尾板
第一部分：农杆菌介导转化水稻
1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101
2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。抽纸机
3、农杆菌感受态细胞的制备：
1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。 2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；
3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；
移动充电器4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；
5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；
6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；
制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：
1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；
2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；
3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；
4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）
5、重组农杆菌鉴定：
1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）
2） 小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
3）质粒酶切或PCR鉴定。
6、三亲交配法：
参考一：
1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养；
（pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）
laflof
2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养；
3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养；
4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；
5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜；
6） 挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；
（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）
7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落；
（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）
8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；
9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。
10）将阳性单菌落再次划线纯化。
三亲交配法：
参考二：
1)从保存根癌农杆菌LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于10m1不含
抗生素的LB液体培养基中，28℃ , 200rpm培养24h;
2)从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB
液体培养基中，37℃，250rpm培养约8h;
3)从保存辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗
生素的LB液体培养基中，37℃ , 250rpm培养约8h;
4)分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于
无抗生素的LB平板上，28℃培养过夜;
5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kan 50ug/ml,Str 25ug/ml和Rif 25ug/ml的LB平板上，28℃培养过夜;同时各取1, 2, 3步骤中的菌液100u}分别涂布于含
有三种抗生素的LB平板上，作为对照。
注意一、农杆菌提取质粒，拷贝数较低，很难用酶切鉴定的方法鉴别。因此一般用PCR鉴定。（PCR鉴定时要做好阴性对照。一般以未带有目的基因的空载体和未经转化的空农杆菌做对照）。另外，未完善起见，可做回转化：即将农杆菌中提取的质粒电泳和PCR鉴定后，再将其回转到大肠杆菌中，再提取质粒酶切鉴定。
注意二、LBA4404为利福平和链霉素抗性，EHA105为利福平抗性，pRK2013为Kan抗性
注意三、
1）、利福平，溶于甲醇或氢氧化钠溶解后无菌蒸馏水定容，贮液20mg/ml，-20保存三个月，使用浓度50~100L。
2）、利福平(Rif)先用少量无水乙醇溶解，最后用无菌水配成50mg/ml的母液，过滤灭菌。
3）、利福平用甲醇配成浓度为20mg/ml，于－20度保存。工作浓度50ug/mltxue
4）、链霉素用水融解至浓度为10 mg/ml后于－20度保存。工作浓度50ug/ml
5）、溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
抗生素 储存液 工作浓度
浓度(mg/ml) 保存条件 严紧型质粒(μg/ml) 松弛型质粒(μg/ml)
氨苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60
羧苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60
氯霉素 34 (溶于乙醇) -20℃ 25 170
卡那霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50
链霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50
四环素 5 (溶于乙醇) -20℃ 10 50
液化气燃烧器7、水稻胚性愈伤组织的诱导
取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min（或75％酒精浸泡1min），再于0.1%中浸泡15min（或再转入20％的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min），超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放35粒，28℃暗培养4－5d，切除胚根，继续培养12-15d，待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代2-3次；成熟胚去壳，用镊子将有胚的一半切下，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。 28℃暗培养至长出愈伤组织。选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。（第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化）
8、根癌农杆菌的培养
平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"
ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str），28℃摇床过夜，再按1%接种量转接入50mL同样培养基中（含相应抗生素）培养8小时左右至OD600为0.5左右。
4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。然后用5mL含100 uM AS的AAM液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含100uM AS的AAM液培中，28℃摇床上培养至OD600=0.5。
9、愈伤组织的预培养
取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜鲜黄的2－3mm的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养基，27℃暗培养3－4天。生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。
10、愈伤组织与根癌农杆菌的共培养
取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织（预培养4d的水稻幼胚去掉胚芽或继代2-3周后2-3mm的愈伤颗粒转入新鲜培养基中预培养4d），置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液（含100uM AS）中10-15min后将幼胚取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到共培养培养基上，于28℃（或25℃）暗培养2－3天。
11、洗除农杆菌
共培养2－3天后，即农杆菌生长至可见愈伤下有少量菌斑时，挑取共培养的愈伤置于无菌三角瓶中，用（含有250mg"L-1羧苄青霉素的）无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。最后一次清洗时静止1小时，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水，静止30－50min，期间振荡几次，倒掉液体，置愈伤于无菌滤纸上凉干，然后转移到筛选培养基上，置25℃培养箱内暗培养。
11、抗性愈伤的筛选
将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接1次。培养4－8周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。挑选这些抗性愈伤继续在选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。
（并转入筛选培养基N6-S1中，进行选择培养。两周后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织，转到N6-S2筛选培养基上继续筛选2-3代，2周/代）。
（N6 -S1：N6，100mg"L-1G418，250mg"L-1羧苄青霉素）
（N6 -S2：N6，50mg"L-1G418， 125mg"L-1羧苄青霉素）
12、抗性愈伤的分化培养
经抗生素筛选长出的抗性愈伤，PCR初步鉴定后，转入分化培养基中继续培养，26℃暗培养1周，然后转入25℃光照培养（12h光照，12h黑暗）。
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