一种盘基网柄菌细胞同步化方法

1.本发明属于细胞培育技术领域，具体涉及一种盘基网柄菌细胞同步化方法。

背景技术：

2.盘基网柄菌是一种真核生物，因其培养条件简单、生活周期短、易于观察等特点，常被选作研究细胞发育、运动、分裂的简单模式生物。同时，盘基网柄菌细胞与哺乳动物的细胞在行为、结构和信号通路方面有很多类似之处。它作为一种重要模式生物在研究多细胞起源、发育和人类其他致病机理等方面都发挥着重要作用，同时也为解决哺乳动物发育中的一些难题提供了帮助。与哺乳动物细胞表达载体相比，盘基网柄菌具有成本低、细胞生长快、易于大规模培养等优点，到今天为止已经成功表达了多种具有生物活性的复杂糖蛋白。因此，盘基网柄菌很可能成为糖蛋白表达系统的重要表达系统。
3.近年来，肿瘤、癌症等都是严重威胁着人类健康的疾病。研究发现，这些疾病的发育都与其细胞周期的调控密切相关，无论是原癌基因的激活还是抑癌基因的失控，最终都与细胞周期的调控相联系。研究表明，许多抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡或杀死肿瘤细胞的敏感性几乎都依赖于细胞周期，而体中的细胞在一般条件下都处于不同的细胞周期时相中，不同时期的细胞对药物的敏感程度不同。将细胞同步化处理到同一时期，选择适当时间点给予抗瘤、抗癌药物乃至放射作为突破口或将成为提高肿瘤、癌症效果的一条有效途径。所以为了更好地研究某时期细胞的增殖、代谢、凋亡，我们需要利用实验的方法将体中处于不同时相的细胞调整为同一时相中，这就是细胞同步化技术。
4.细胞同步化可以分为自然同步化和人工同步化两种。自然同步化对细胞本身基本没有伤害，但自然同步化所需周期长、同步化效率低；人工同步化虽然较自然同步化效率高，但对细胞本身来说总会有或多或少的影响，如何减少同步化过程中对细胞造成的伤害是目前研究过程急需解决的问题。

技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明综合了人工同步化和自然同步化的优缺点之后，选择了除人工同步化和自然同步化之外的另外一种同步化方法，即先饥饿处理盘基网柄菌一段时间后再加入其营养物质克雷伯氏菌，使其在短时间内能够相对快速地进行同步化分裂到某一时期。该研究方法在缩短了同步化时间的同时也可以有效防止药物之间的干扰对实验结果产生影响；
6.为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
7.一种盘基网柄菌细胞同步化方法，包括以下步骤：
8.s1：盘基网柄菌细胞培养；
9.s2：盘基网柄菌细胞饥饿处理；
10.s3：给饥饿处理的盘基网柄菌细胞重新提供食物ka(克来伯氏菌)；
11.s4：分时段采集重新给予ka后的细胞分裂情况。
12.优选的，所述盘基网柄菌细胞的接种方法及条件为在12孔板中加入2ml的hl5培养基，接种104个指数生长期的细胞，轻轻混匀，22℃环境中使细胞贴壁；
13.优选的，所述饥饿处理细胞经db缓冲液处理，处理方法为用真空泵将12孔板中的培养液吸去，沿孔壁轻轻的加入2ml新配置的db缓冲液；吸去db缓冲液，再次加入2ml新的db缓冲液，22℃环境中使细胞接收饥饿刺激；
14.优选的，所述饥饿处理方法为db缓冲液，将细胞分别饥饿1、2、3、4、5、6h后在缓冲液中重新给予食物ka；
15.优选的，所述分裂情况信息采集前用真空泵装置将12孔板内的db吸去，重新加入混有ka的db缓冲液，用实时录像系统分别记录饥饿1-6h的细胞分裂情况，获得细胞分裂较多的对应饥饿时间范围；
16.优选的，所述饥饿处理范围确定后，在细胞分裂现象比较明显的时间区域重新加入营养物ka，用实时录像系统分别记录饥饿1-6h的细胞分裂情况，获得细胞分裂较多的对应饥饿时间范围；
17.优选的，所述分裂现象比较明显的时间区域为大于2.5h之后。
18.本发明的有益效果是：
19.利用本发明提供的一种盘基网柄菌细胞同步化方法在缩短了同步化时间的同时也可以有效防止药物之间的干扰对实验结果产生影响。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为细胞饥饿处理1-6h的细胞分裂结果示意图；
22.图2为饥饿处理2-4h细胞分裂均值图(误差波动)；
23.图3为饥饿处理2.5h分裂率均值图(误差波动)；
24.图4为正常培养6h分裂率均值图(误差波动)；
25.图5为饥饿处理2.5h与正常培养6h分裂率对比图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.一种盘基网柄菌细胞同步化方法，包括以下步骤：
29.s1：盘基网柄菌细胞培养；
30.s2：盘基网柄菌细胞饥饿处理；
31.s3：饥饿处理中细胞分裂情况信息采集；
32.s4：向饥饿处理后的盘基网柄菌细胞提供营养物质；
33.优选的，所述盘基网柄菌细胞的接种方法及条件为在12孔板中加入2ml的hl5培养基，接种104个指数生长期细胞0.2ml，轻轻混匀，22℃培养；
34.优选的，所述饥饿处理细胞经db缓冲液处理，处理方法为用真空泵将12孔板中的培养液吸去，沿孔壁轻轻的加入2ml新配置的db缓冲液；吸去db缓冲液，再次加入2ml新的db缓冲液；
35.优选的，所述饥饿处理方法为db缓冲液，将细胞分别饥饿1-6h；
36.优选的，所述分裂情况信息采集前用真空泵装置将12孔板内的db吸去，用实时录像系统分别记录饥饿1-6h时细胞的分裂情况；
37.优选的，所述饥饿处理1-6h范围确定后，在细胞同步化分裂现象比较明显的时间区域重新加入营养物ka。
38.优选的，所述分裂现象比较明显的时间区域为大于2.5h之后。
39.实施例2
40.不同饥饿时间对细胞同步化速率的影响
41.为了研究饥饿处理时间对细胞的同步化情况的影响，实验选择了饥饿处理的6个时间段，分别是1h、2h、3h、4h、5h、6h，当饥饿处理相应时间后，再给予ka食物，同时开始记录细胞分裂情况。统计结果如图1所示，细胞在饥饿3h后，细胞的分裂数最多。而饥饿时间在少于2h或大于5h，细胞的分裂数目都很少，这可能跟细胞的多细胞发育阶段有关。在饥饿2h以内，细胞处于开始聚集的初期，可能细胞内的信号通路与营养阶段相似，而在饥饿5h以后，细胞已经大量分泌环腺苷酸，且已经发生聚集，即便再给予食物，也很难恢复到营养阶段。
42.为了进一步确定最佳饥饿处理时间，实验设计在前面实验结果的基础上继续缩小时间梯度为2h、2.5h、3h、3.5h、4h，同样在完成饥饿处理后给予食物。统计分析细胞分裂结果如图2所示，从结果中可以看出，细胞在饥饿2.5h后给予食物ka，可以产生大量的分裂细胞，即大量的细胞已经被同步化。
43.实施例3
44.饥饿处理2.5h和正常培养下细胞同步化分裂的比较
45.在确定了饥饿处理2.5h为最佳同步化分裂时间后，将饥饿处理2.5h细胞的同步化分裂结果作为实验组。继续对饥饿处理2.5h后的同步化结果进行探究，出饥饿处理2.5h后加入营养物质ka，等待0.5h后连续拍照观察3h，可以明显观察到拍照观察到2h时细胞分裂率最高(如图3)，整个实验历时为6h。在6h时间范围内，细胞的同步化分裂现象比较明显，统计整个实验过程中的同步化分裂速率，可以发现饥饿处理2.5h细胞的同步化分裂率达到59.51％。将饥饿处理2.5h细胞的同步化分裂结果作为实验组。
46.将正常培养6h下盘基网柄菌的分裂结果进行整理作为对照组。可以发现，正常培养下的细胞，前三小时基本不存在同步化现象，到4-6h时逐渐出现同步化现象，即细胞分裂。但是细胞同步化分裂率很低，同步化现象不明显，观察可知，正常培养6h下细胞的总同步化分裂率仅达7.04％。
47.为了更直观地感受饥饿处理2.5h与正常培养6h下盘基网柄菌细胞同步化分裂率的差异，我们重复实验、统计数据并作出对比图可以看出：饥饿处理2.5h，细胞的分裂率达到59.51％，而正常培养6h，细胞的分裂率仅有7.04％，远小于饥饿处理2.5h后细胞的同步
化效率。也就是说，饥饿处理能有效提升细胞的同步化效率，在短时间内将细胞有效地同步化到了某一特定时期。
48.从以上结果分析我们可以明显看出：正常培养情况下盘基网柄菌细胞同步化分裂所需时间长，而且细胞同步化分裂的现象不明显。对盘基网柄菌进行饥饿处理后再加入食物ka，可以诱导盘基网柄菌进行同步化分裂，而其中对盘基网柄菌进行饥饿处理2.5h后加入营养物质ka，细胞的同步化效果最显著，同步化程度在短时间内平均能达到59.51％。与正常培养下的盘基网柄菌的细胞同步化效果对比，饥饿处理不仅可以大大提高盘基网柄菌细胞同步化分裂的速率，同时也在一定程度上也能缩短细胞同步化的时间，为医疗事业等的研究提供了一种新颖的思路。

技术特征：

1.一种盘基网柄菌细胞同步化方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：盘基网柄菌细胞培养；s2：盘基网柄菌细胞饥饿处理；s3：给饥饿处理的盘基网柄菌细胞重新提供食物ka(克来伯氏菌)；s4：分时段采集重新给予ka后的细胞分裂情况。2.根据权利要求1所述一种盘基网柄菌细胞同步化方法，其特征在于，所述盘基网柄菌细胞的接种方法及条件为在12孔板中加入2ml的hl5培养基，接种104个指数生长期的细胞，轻轻混匀，22℃环境中使细胞贴壁。3.根据权利要求1所述一种盘基网柄菌细胞同步化方法，其特征在于，所述饥饿处理细胞经db缓冲液处理，处理方法为用真空泵将12孔板中的培养液吸去，沿孔壁轻轻的加入2ml新配置的db缓冲液；吸去db缓冲液，再次加入2ml新的db缓冲液，22℃环境中使细胞接收饥饿刺激。4.根据权利要求1所述一种盘基网柄菌细胞同步化方法，其特征在于，所述饥饿处理方法为db缓冲液，将细胞分别饥饿1、2、3、4、5、6h后在缓冲液中重新给予食物ka。5.根据权利要求1所述一种盘基网柄菌细胞同步化方法，其特征在于，所述分裂情况信息采集前用真空泵装置将12孔板内的db吸去，重新加入混有ka的db缓冲液，用实时录像系统分别记录饥饿1-6h的细胞分裂情况，获得细胞分裂较多的对应饥饿时间范围。6.根据权利要求1所述一种盘基网柄菌细胞同步化方法，其特征在于，所述饥饿处理范围确定后，在细胞分裂现象比较明显的时间区域重新加入营养物ka，用实时录像系统分别记录饥饿1-6h的细胞分裂情况，获得细胞分裂较多的对应饥饿时间范围。7.根据权利要求6所述一种盘基网柄菌细胞同步化方法，其特征在于，所述分裂现象比较明显的时间区域为大于2.5h之后。

技术总结

本发明公开了一种盘基网柄菌细胞同步化方法，主要包括：S1：盘基网柄菌细胞培养；S2：盘基网柄菌细胞饥饿处理；S3：饥饿处理中细胞分裂情况信息采集；S4：向饥饿处理后的盘基网柄菌细胞重新提供营养物质；本发明综合了人工同步化和自然同步化的优缺点之后，鉴于盘基网柄菌细胞生命周期的特殊性，选择了除人工同步化和自然同步化之外的另外一种同步化方法，即先饥饿处理盘基网柄菌一段时间后再加入其营养物质克雷伯氏菌，使其在短时间内能够相对快速地进行同步化分裂到某一时期。该研究方法在缩短了同步化时间的同时也可以有效防止药物之间的干扰对实验结果产生影响。间的干扰对实验结果产生影响。间的干扰对实验结果产生影响。